第十节谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活力测定VIP免费

1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定 1.3.6.2.1 原理 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化 GSH 氧化的反应速度，及单位时间内 GSH 减少的量来表示，GSH 和 5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子，于 423nm 波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出 GSH 减少的量，由于 GSH 能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的 GSH 减少。 1.3.6.2.2 试剂和仪器 仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器 试剂：叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0 NaN3 16.25mg 终浓度 2.5mmol/L EDTA-Na2 7.44mg 终浓度 0.2mmol/L Na2HPO4 1.732g 终浓度 0.2mol/L NaH2PO4 1.076g 终浓度 0.2mol/L 加蒸馏水至100mL，用少量 HCL、NaOH 调pH7.0，4℃保存。 1mmol/L 谷胱甘肽（还原型 GSH）溶液 GSH 30.7mg 加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存 1－2 日。 1.25－1.5mmol/LH2O2 溶液 取 30％H2O2 0.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释 10 倍即可。 偏磷酸沉淀液 HPO3 16.7g（先用蒸馏水溶解） EDTA 0.5g NaCl 280g 加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。 0.32mol/LNa2HPO4 溶液: Na2HPO4 22.7g 加蒸馏水至500mL，室温保存。 DTNB 显色液 DTNB 40mg 柠檬酸三钠 1.0g 加蒸馏水至100mL，4℃避光保存 1 个月。 0.2M 磷酸缓冲液pH7.4 0.9%生理盐水 1.3.6.2.3 实验步骤 1.3.6.2.3.1 样品制备 溶血液：取鼠血 10μ l 加入到 1mL 双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血 1:100 待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d 内测定，若4℃存放，28h 内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。 组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M 磷酸缓冲液，以20000r/min 匀浆10s，间歇30s，反复3 次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g 离心 10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片...