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第十节谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活力测定VIP免费

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1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定 1.3.6.2.1 原理 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要,其活力以催化 GSH 氧化的反应速度,及单位时间内 GSH 减少的量来表示,GSH 和 5,5’-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)反应在GSH-Px催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子,于 423nm 波长有最大吸收峰,测定该离子浓度,即可计算出 GSH 减少的量,由于 GSH 能进行非酶反应氧化,所以最后计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的 GSH 减少。 1.3.6.2.2 试剂和仪器 仪器:可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器 试剂:叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0 NaN3 16.25mg 终浓度 2.5mmol/L EDTA-Na2 7.44mg 终浓度 0.2mmol/L Na2HPO4 1.732g 终浓度 0.2mol/L NaH2PO4 1.076g 终浓度 0.2mol/L 加蒸馏水至100mL,用少量 HCL、NaOH 调pH7.0,4℃保存。 1mmol/L 谷胱甘肽(还原型 GSH)溶液 GSH 30.7mg 加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL,临用前配制,冰冻保存 1-2 日。 1.25-1.5mmol/LH2O2 溶液 取 30%H2O2 0.15-0.17mL,用双蒸水稀释至100mL,作为贮备液,4℃避光保存,临用前将贮备液用双蒸水稀释 10 倍即可。 偏磷酸沉淀液 HPO3 16.7g(先用蒸馏水溶解) EDTA 0.5g NaCl 280g 加蒸馏水至1000mL,用普通滤纸过滤,室温保存。 0.32mol/LNa2HPO4 溶液: Na2HPO4 22.7g 加蒸馏水至500mL,室温保存。 DTNB 显色液 DTNB 40mg 柠檬酸三钠 1.0g 加蒸馏水至100mL,4℃避光保存 1 个月。 0.2M 磷酸缓冲液pH7.4 0.9%生理盐水 1.3.6.2.3 实验步骤 1.3.6.2.3.1 样品制备 溶血液:取鼠血 10μ l 加入到 1mL 双蒸水中,充分振摇,使之全部溶血 1:100 待测,4h内测定酶活力。若当天来不及测定,将肝素抗凝全血置-20℃冻存,3d 内测定,若4℃存放,28h 内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。 组织上清液:动物禁食过夜,处死后,立即取出所需脏器,放入冷生理盐水中洗去浮血,剔除脂肪及结缔组织,滤纸吸干后,在冰浴上剪成碎块,称取适量组织,加冷0.2M 磷酸缓冲液,以20000r/min 匀浆10s,间歇30s,反复3 次制成5%组织匀浆,操作在冰浴中进行,匀浆以12500×g 离心 10min(低温高速离心机),以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片...

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