通过LAMP实现DNA 的线性扩增 一、LAMP 原理 60-65℃是双链 DNA 复性及延伸的中间温度，DNA 在 65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA 在此温度下合成是可能的。利用 4 种特异引物依靠一种高活性链置换 DNA 聚合酶。使得链置换 DNA 合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第 1 阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物 FIP 的F2 序列首先与模板 F2c 结合，在链置换型 DNA 聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物 F3 与模板 F3c 结合并延伸，置换出完整的FIP 连接的互补单链。FIP 上的F1c 与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物 BIP 与 B3 先后启动类似于 FIP 和 F3 的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以 3' 末端的Fl 区段为起点。以自身为模板，进行DNA 合成延伸形成茎环状结构。该结构是 LAMP 基因扩增循环的起始结构。 第 2 阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP 与茎环的F2c 区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以 3’末端的B1 区段为起点，以自身为模板。进行 DNA 合成延伸及链置换．形成长短不一的2 条新茎环状结构的DNA，BIP 引物上的B2 与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA 长度增加一倍。在反应体系中添加2 条环状引物 LF和 LB，它 们 也分别 与茎环状结构结合启动链置换合成，周 而 复始。扩增的最后产物是具 有 不同 个数 茎环结构、不同 长度 DNA 的混 合物。且产物 DNA 为扩增靶 序列的交替 反向重 复序列。 二、实验流程 二、阶段实验及需要解决的问题 (一) 实验准备阶段 1、引物设计 2、模板中引入合适的酶切位点 3、不同梯度拷贝数模板的准备 4、反应仪器的准备 5、具有链置换活性的 DNA 聚合酶的选择 6、扩增产物的检测方法 7、扩增产物量的检测 (二) 实验阶段 1、反应体系的确定 2、模板浓度的优化 3、反应时间的优化 4、扩增产物的检测 5、以 PCR 的扩增作为对照 三、具体实验方案 (一) 引物的设计 LAMP 引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。 1、 LAMP 引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因 3' 端的 F3c、F2c 和 Flc 区以及 5' 端的 Bl、B2 和 B3 区...
