Western Blotting 常见问题及解决方法 （参照Pierce 公司讲座PPT） 1.比较均一的高背景 原因： 解决办法 抗体浓度太高 优化/降低一抗和二抗浓度 封闭液不适合 比较尝试不同的封闭液 封闭不完全 封闭液的选择与优化 增加封闭液中蛋白质浓度 优化封闭时间和温度（RT 至少1 小时；4°过夜） 封闭液中加入 Tw een-20；浓度0.05％ 抗体稀释液中加入 Tw een-20；浓度0.05％ 抗体与其它蛋白质交叉反应 更换不同的封闭液；勿在 Biotin/avidin 体系中使用脱脂奶粉封闭 降低二抗浓度 检测二抗与膜的交叉反应性 原因： 解决办法 漂洗不完全 增加漂洗时间和缓冲液体积 漂洗液中加入 Tw een-20；浓度0.05％ 曝光时间太长 缩短曝光时间 膜的问题 使用干净镊子；戴手套操作 换一张新膜 用足够的液体，膜始终保持湿润 孵育时使用脱色摇床 避免膜重叠，互相覆盖 小心操作，勿毁损膜 缓冲液污染 使用新缓冲液 过滤缓冲液 2. 斑点、发泡式或闪烁式的高背景 原因： 解决办法 抗体浓度太高 优化/降低一抗和二抗浓度 二抗聚集 0.2um 过滤或更换新二抗 封闭液不适合 比较尝试不同的封闭液 封闭不完全 封闭液的选择与优化 增加封闭液中蛋白质浓度 优化封闭时间和温度（RT 至少1 小时；4°过夜） 封闭液中加入 Tw een-20；浓度0.05％ 抗体稀释液中加入 Tw een-20；浓度0.05％ 抗体与其它蛋白质的交叉反应 更换不同的封闭液；勿在 Biotin/avidin 体系中使用脱脂奶粉封闭 减少二抗浓度 检测二抗与膜的交叉反应性 原因 解决办法 膜没有正确湿润 使用干净镊子；戴手套操作 换一张新膜 用足够的液体，膜始终保持湿润 孵育时使用脱色摇床 避免膜重叠，互相覆盖 小心操作，勿毁损膜 缓冲液污染 使用新缓冲液 过滤缓冲液 仪器污染 保证所有仪器，用具干净 确保膜上无残留胶 3. 信号弱或者无信号 原因 解决办法 转膜不完全 1.转膜后，染胶以决定转膜效率 2.使用 Memcode 染膜以决定转膜效率 3.保证转膜时胶与膜充分结合 4.滤纸－膜－胶，电极方向正确装配 5.根据说明书，对膜进行处理如湿润 6.电转时防止过热 7.使用阳性对照或预染 Marker 8.优化转移时间和电流 9.使用 Pierce 转膜缓冲液 10.保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇） 蛋白质与膜结合不充分 加20％甲醇于转膜缓冲液； 低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜 抗体 增加抗体浓度；抗体与抗原结合...
