单克隆抗体的单克隆抗体的制备制备目录目录⒈单克隆抗体的简介⒉单克隆抗体的制备单克隆抗体的简介单克隆抗体的简介单抗的定义：由一个B细胞克隆或其杂交瘤或通过分子生物学手段克隆构建单个抗体基因转染的细胞系产生的只能识别一种表位的高度均质性抗体。单抗制备要点：制备出一个能够稳定无限遗传的能分泌抗体的B细胞。因此，需解决的两个基本问题：1.一个能分泌抗体的B细胞免疫动物;2.能够稳定遗传B细胞与瘤细胞融合筛选11NielsK.JerneGeorgesJ.F.KöhlerCésarMilsteinBB淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理B细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞流程抗原制备免疫动物骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的筛选及克隆化单克隆抗体大规模制备及纯化单克隆抗体的鉴定单克隆抗体制备的主要步骤单克隆抗体制备的主要步骤一、抗原一、抗原1、分子足够大；2、外源性强；3、结构尽量复杂；4、可降解性好一个良好的抗原必须具体的条件：1、纯化的天然蛋白质；2、纯化的重组蛋白；3、人工合成多肽；4、小分子物质；5、组织、全细胞或细胞组分抗原常用的制备方法：BB淋巴细胞在目的抗原刺激下增殖、分化，淋巴细胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特异性抗体的形成能分泌特异性抗体的BB淋巴细胞，有利于细淋巴细胞，有利于细胞融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。根据胞融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。根据抗体亲和力成熟机制，通过多次免疫使抗体亲和力成熟机制，通过多次免疫使BB细胞分细胞分泌高亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌泌高亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌高亲和力抗体，有更高的应用价值。高亲和力抗体，有更高的应用价值。二、免疫动物二、免疫动物免疫目的：采用与骨髓瘤供体同一品系的动物免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，获得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。动物的选择：动物对抗原刺激易产生免疫应答反应制备单抗使用的主流动物：小鼠（最常用BALB/c）免疫方案的确定：在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。脾（spleen）抗原脾（spleen）1.制备良好的抗原2.选择合适的免疫动物3.确立适宜的免疫方案所选骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同三、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备三、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备骨髓瘤细胞系的选择要点：选择DNA合成主要途径缺陷型的骨髓瘤细胞（HGPRT-或TK-）饲养细胞的作用：饲养细胞的作用：小鼠腹腔巨噬细胞小鼠腹腔巨噬细胞小鼠脾细胞、胸腺细胞、放射线照射的成纤维细胞小鼠脾细胞、胸腺细胞、放射线照射的成纤维细胞系系饲养细胞（feedercell）：增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对细胞密度的要求细胞密度的要求吞噬清除死亡的细胞吞噬清除死亡的细胞分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长饲养细胞的种类和制备方法：饲养细胞的种类和制备方法：四、细胞融合四、细胞融合PEG脾细胞的准备骨髓瘤细胞的准备细胞融合骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合1:10或1:5，加入促融剂PEG在聚乙二醇作用下B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞③瘤-瘤融合细胞未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成有主要途径和补偿途径。当有氨基碟呤存在时，能够阻断DNA合成的主要途径，需通过补偿途径合成DNA，这时就需要次黄嘌呤利用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）合成DNA，或胸腺嘧啶核苷利用胸腺嘧啶核苷激酶（TK）合成DNA。融合后3~4天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。融合后第7~9天取培养上清，检测特异性抗体。细胞生长情况六、杂交瘤细胞的筛选及克隆化六、杂交瘤细胞的筛选及克隆化•在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必...
