DNA的琼脂糖凝胶电泳分子生物学基本技术三峡大学医学院生物化学教研室凝胶电泳凝胶电泳•凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。物质作支持体的电泳。•特点：特点：1.1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。动。2.2.操作方法简便，电泳速度快。操作方法简便，电泳速度快。3.3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。4.4.适用于生化、免疫等定性定量测定。适用于生化、免疫等定性定量测定。琼脂糖凝胶电泳•琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。•该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。•当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。•此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。琼脂•琼脂糖–琼脂糖是由琼脂中提取出来的，D-半乳糖和3、6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖。–中性物质，不带电荷D-D-半乳糖半乳糖33，，6-6-脱水脱水--L-L-半半乳糖乳糖琼脂糖链依琼脂糖链依分子内和分子间氢键分子内和分子间氢键及其它力的作用及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型大网孔型凝胶。凝胶。琼脂糖凝胶的优点琼脂糖凝胶的优点(1)操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。缺点：缺点：1.1.机械强度差机械强度差，易破碎，浓度不能太低。，易破碎，浓度不能太低。2.2.易被细菌污染易被细菌污染，不易保存，临用前配制。，不易保存，临用前配制。3.3.琼脂糖支持层上的琼脂糖支持层上的区带易于扩散区带易于扩散，电泳后，电泳后必须立即固定染色。必须立即固定染色。4.4.与与PAGEPAGE相比，相比，分子筛作用小分子筛作用小，区带少。，区带少。影响琼脂糖凝胶电泳的因素•DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比；•琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；•DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。琼脂糖凝胶浓度与可分辨的DNA大小范围的关系琼脂糖凝胶浓度/(%)可分辨的线性DNA大小范围/(kb)0.360~50.620~10.710~0.80.97~0.51.26~0.41.54~0.22.03~0.1核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系•在分子量相当的情况下，不同构型的DNA的移动速度次序如下：–共价闭环DNA(covalentlyclosedcircular，简称cccDNA)＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。RelaxedcircleLinearizedformSuper-coiledform质粒•离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。•在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动；•在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。电泳缓冲液•常用三种缓冲液–Tris-硼酸（TBE）–Tris-乙酸（TAE）–Tris-磷酸（TPE）•Tris（三羟甲基氨基甲烷）：是一种生物碱，常用于生物实验中配制各种pH值的缓冲液。1M的Tris溶液的pH值大约是10～11。•EDTA可螯合二价阳离子，抑制DNA酶的活性，防止DNA降解。•TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀，•TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。EDTA•乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid），是一种有机化合物。它是一个...
