634901SMARTcDNA文库构建实验流程(clontech)

SMART cDNA 文库构建试剂盒实验流程 1 / 9 SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒 操作一览 (PT3000-2) 本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒 (Cat. No. 634901) 的说明书。 A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成 1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂： 1–3 μl RNA 样本 (对照反应，使用1 μl 的对照RNA) 1 μl SMART™ IV Oligonucleotide 1 μl CDS III/3' PCR Primer 如果总体积<5 μl 时，用水补齐至5 μl。 2. 混匀试剂并瞬时离心。 3. 72°C孵育2 min。冰上冷却2 min。 4. 瞬时短暂离心。 5. 向每管反应中加入以下试剂： 2.0 μl 5X First-Strand Buffer 1.0 μl DTT (20 mM) 1.0 μl dNTP Mix (10 mM) 1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase 10.0 μl 总体积 6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。 7. 42°C孵育1 hr。之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。 8.引物延伸合成ds cDNA 分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。 B. LD PCR扩增合成cDNA 1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂： 2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7) 80 μl Deionized H2O 10 μl 10X Advantage 2 PCR Buffer 2 μl 50X dNTP Mix 2 μl 5' PCR Primer 2 μl CDS III/3' PCR Primer 2 μl 50X Advantage 2 Polymerase Mix 100 μl 总体积 2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。 3. 如果需要可以向管中加2滴矿物油，盖上管盖，置于预热(95°C)的PCR仪器中。 SMART cDNA 文库构建试剂盒实验流程 2 / 9 4. 以下程序选择一种进行扩增： GeneAmp 480 GeneAmp 2400/9600 • 95℃ 1 min • 95℃ 20 sec • x cycles*: • x cycles*: 95℃ 15 sec 95℃ 5 sec 68℃ 6 min 68℃ 6 min *参考Table I 中最优循环数的使用。 5. 取5μl 产物在1.1% 琼脂糖/EtBr 胶上进行检测，若检测结果与预期不符时，请参考疑难解答指南(说明书的Section VIII)。 6. 然后进入步骤 D。 C. 引物延伸扩增ds cDNA 1. 混匀以下试剂： 11 μl First-Strand cDNA (from Step A.8) 71 μl Deionized H2O 10 μl 10X Advantage 2 PCR Buffer 2 μl dNTP Mix 2 μl 5'...