免疫组化入门实验操作 一、实验目的： 1. 了解免疫组化基本原理。 2. 了解免疫组化实验操作及注意事项。 3. 免疫组化结果判定。 通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。 二、实验原理： 三、实验材料： 一抗：CD5、CK8、Ki67 二抗： MaxVision3 其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS 缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。 四、实验步骤： 1. 脱蜡水化 二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。 2. 抗原修复 高压锅中加入1200mL 柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。 3. 过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm 处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴） 过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS 冲洗3×3min。 4. 一抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm 外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60 分钟，PBS 冲洗3×3min。 5. 二抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm 外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM 试剂，室温下孵育30 分钟，PBS 冲洗3×3min。 6. DAB 甩去PBS 液，纸巾擦干组织3mm 外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色 5 分钟，自来水冲洗。 7. 苏木素复染 每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30 秒后自来水冲洗30s 以上，或浸泡于 PBS 中30s 以上再自来水冲洗。 8. 封片 梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。 修复方法 一、 柠檬酸缓冲液高温高压修复法 取一定量 pH=6.0 柠檬酸盐缓冲液（800-1500ml）于压力锅中，大火加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片至于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。盖上锅盖，扣上压力阀，将功率调至 800W,继续加热至喷气，从喷气开始计时，1.5 分钟后，压力锅离开热源，室温冷却 10 分钟后用自来水冲淋高压锅外壁加速冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗...
