单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B 淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫 B 细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在 HAT 培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成 DNA 的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成 DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此 能在 HAT 培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可 筛 选出 能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或 体外培养，即 可 无限制地 大量制备单克隆抗体。 三 、试 剂 与器 材 ： 细胞培养板 、解剖 器 械 、平 皿 、酶标 仪 、加 样 器 、细胞计 数 板 、CO2 培养箱 、倒 置 显 微 镜 等。 四 、操 作 方法： 1、抗原制备； 一般 而言 ，抗原的纯度 不很 重要，特别 是免疫原性较 强 的抗原。 A． 可 溶 性抗原（蛋 白 质 ） 以 1m g/m l～ 5m g／ m l 的溶 液 加 等量的弗 氏 完全佐 剂 乳 化，分多 点 小 鼠 皮 下 注 射 ，总 量为 0.3m l～ 0.6m l，间 隔 ３ ～ ５ 周 再 同 样 注射 一次，１ ０ 天 后，断尾 取 血 一滴 ，测抗体效价，选滴 度 高 的小 鼠 做 融合试 验。一 个 月 后 可 以 经 静 脉 （ 尾 静 脉 ） 给 予 无 佐 剂 抗 原 0.2ml～ 0.4ml， ３ ～ ４ 天 后 ， 杀死 小 鼠 取 脾 做 融 合 用 。 B. 颗 粒 性 抗 原 如 抗 原 来 源 方 便 ， 可 以 不 加 佐 剂 而 增 加 免 疫 次 数 ， 缩 短 间 隔时 间 。 例 如 用 羊 红 血 球 免 疫 小 白 鼠 ， 以 １ ％ 浓 度 每 只 皮 下 ...
