实验十一 质粒 DNA 的提取与纯化 一、实验目的与原理 质粒多为一些双链、环状的 DNA 分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的 DNA 载体。提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒 DNA 的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。 二、材料与试剂 1、材料：大肠杆菌 2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪 3、试剂： Solu tion I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4) 10 mM EDTA(pH8.0) 50 mM 葡萄糖 高压灭菌，4℃保存 Solu tion II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用 Solu tion III 5 N KAc pH4.8 高压灭菌，4℃保存 3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB 培养基，电泳试剂 三、操作步骤 1、细菌繁殖 LB 培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜 2、离心 10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液 3、沉淀（菌体细胞）预冷的 TES 缓冲液洗涤，离心 10 min，5000 rpm, 4℃ 加入预冷的 1 ml Solu tion I，冰浴，10 min 4、重新悬浮，加入 150 u l 溶菌酶母液，室温放置 5 min 5、加入 1.2 ml Solu tion II, 冰浴，5 min 6、加入 0.9 ml 预冷乙酸钾，混匀，离心 10 min，12000 rpm, 4℃ 7、加入 1.5 ml 异丙醇，-20℃冰箱内放置 15 min 8、离心 10 min，12000 rpm, 4℃ 9、取沉淀，悬于 400 u l TE 缓冲液中 10、加入 40 u l，3 M NaAc 11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀 12、离心 10 min，12000 rpm, 4℃ 13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于 50 u l TE 缓冲液中。 14、电泳检测提取 DNA 的质量 三、结果与分析 超螺旋结构 DNA 四、注意事项 在本实验中，如果不经过RNase 处理，在电泳带中，RNA 会呈现极亮的带，所以，建议使用RNase 处理一下。离心时应注意转速不能太低，太低会导致质粒不纯；也不要太高，否则质粒不易溶解。电泳时应注意电压，电压太高或混有蛋白质杂质时电泳带容易产生偏离和拖尾。在DNA 操作中应尽可能轻地操作（尤其是分别加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ轻轻摇），否则质粒容易断裂，从...
