SMART 技术制备 GS FLX 样品cDNA 详细流程 第一天 一. RNA 的提取 1. 用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook): 1) 在1.5 ml 管中加入600ulRLT 和6ul B-巯基乙醇 2) 取10—30mg 组织样品放入管中,用剪刀或电动匀浆机破碎, 3—5min 3) 12000rpm/3min,取上清移入新管 4) 加入1 倍体积70%乙醇,轻柔混匀(吸打),不能离心,并立即转入收集柱,10000rpm/30s,弃废液。(分两次移吸附柱,离心弃废液后,打开盖子让酒精挥发一下再操作) 5) 加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液 6) 加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 7) 加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液,换新收集管,空转12000rpm/1min 8) 将收集柱移入1.5mlRnase-free 管中,加30—50ulRnase-free water,静置 1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase 去除 DNA,需用87.5ul RNA 溶液,因此用45ul Rnase-free water 洗两次) 9)定量,跑胶 2. 用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除 DNA 污染 1) 反应体系:共 100ul 87.5ul RNA 溶液 10ul buffer RDD 2.5ul Dnase I 储存液(配制:干粉溶于550ul 的Rnase-Free ddH20中,分装,-20℃保存) 2)20—25℃孕育 10min 3. 用 Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化 1)100ul 除 DNA 后的RNA+350ulRLT,混匀 2)加入 250ul 无水乙醇,轻柔混匀,不能离心,并立即移入收集柱,10000rpm/30s,弃废液 3)加入 500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 4)加入 500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液,换新的收集管,空转1min 5) 换 1.5ml管,加 30—50ulRnase-free water,置 1min,10000rpm/1min 6)定量,跑胶 第二天 二. 反转录(SMART Kit,详见 Manual) 1.做逆转录之前对 RNA 的处理: 浓缩 RNA 1)在所提取的RNA 里(大约为 10ug),加无水乙醇(2 倍体积),醋酸钠(3M. PH=15.2 0.1 倍体积) 2)-70℃, 酝酿 40min 或过夜. 3)取出溶液,3000g/1min; 换个方向,12000rpm/5min 4)弃上清,用70%的乙醇洗两次。即加1ml 70%乙醇,把沉淀弹起,12000rpm/5min. 5)弃上清,37℃干燥。 6)加Rnase free water 30---40ul, 分装。-70℃保存! 1. 反转录合成1 链cDNA 需要1ng---2ug 总RNA 或0.5ng—1ug polyA RNA 1) 1—3.5ulRNA+1ul 改进的3‘primer(12uM),( 3‘primer 用时需稀释到 12uM,离心),总反应体积...