提RNA反转录的详细流程VIP专享

SMART 技术制备 GS FLX 样品cDNA 详细流程 第一天 一． RNA 的提取 1. 用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)： 1） 在1.5 ml 管中加入600ulRLT 和6ul B-巯基乙醇 2） 取10—30mg 组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎， 3—5min 3） 12000rpm/3min,取上清移入新管 4） 加入1 倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作) 5） 加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液 6） 加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 7） 加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min 8） 将收集柱移入1.5mlRnase-free 管中，加30—50ulRnase-free water,静置 1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase 去除 DNA,需用87.5ul RNA 溶液，因此用45ul Rnase-free water 洗两次) 9）定量，跑胶 2. 用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除 DNA 污染 1） 反应体系：共 100ul 87.5ul RNA 溶液 10ul buffer RDD 2.5ul Dnase I 储存液（配制：干粉溶于550ul 的Rnase-Free ddH20中，分装，-20℃保存） 2）20—25℃孕育 10min 3. 用 Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化 1）100ul 除 DNA 后的RNA+350ulRLT,混匀 2）加入 250ul 无水乙醇，轻柔混匀，不能离心，并立即移入收集柱，10000rpm/30s，弃废液 3）加入 500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液 4）加入 500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新的收集管，空转1min 5) 换 1.5ml管，加 30—50ulRnase-free water，置 1min,10000rpm/1min 6）定量，跑胶 第二天 二． 反转录（SMART Kit,详见 Manual） 1.做逆转录之前对 RNA 的处理： 浓缩 RNA 1）在所提取的RNA 里（大约为 10ug），加无水乙醇（2 倍体积），醋酸钠（3M. PH=15.2 0.1 倍体积） 2）-70℃, 酝酿 40min 或过夜. 3）取出溶液，3000g/1min; 换个方向，12000rpm/5min 4）弃上清，用70%的乙醇洗两次。即加1ml 70%乙醇，把沉淀弹起，12000rpm/5min. 5）弃上清，37℃干燥。 6）加Rnase free water 30---40ul, 分装。-70℃保存！ 1. 反转录合成1 链cDNA 需要1ng---2ug 总RNA 或0.5ng—1ug polyA RNA 1) 1—3.5ulRNA+1ul 改进的3‘primer(12uM),( 3‘primer 用时需稀释到 12uM，离心)，总反应体积...