细胞冻存和复苏标准操作规程

精品文档---下载后可任意编辑细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)背景知识 ：细胞培育的传代及日常维持过程中，在培育器具、培育液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培育，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。原理 ：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采纳甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采纳快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避开由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰 箱 （ 4℃ 、 -20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培育箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培育瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml 离心管6. 冻 存 管 （ 1 ～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks 液2. 小牛血清3. 培育液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（%）6. 1NHCl7. %NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新奇甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含 10%DMSO 或甘油、10～20%小牛血清的冻存培育液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15ml 离心管中、；3. 离心 1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培育液，加入适量配制好的冻存培育液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管 1～ ml；1精品文档---下载后可任意编辑6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放...