Western-Blot的步骤

1/6的原理及步骤免疫印迹（）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位,应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。一、的原理与或杂交方法类似，但采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、操作步骤（一）蛋白质样品获得：1. 所需试剂：⑴ 蛋白酶抑制剂 mix：hjjhh 储存浓度5mlmix 中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM25ul50uM*TrypsinInhibitor1mg/ml250ul50ug/ml*EGTA(pH8.0)0.5M80ul8mM*EDTA(pH8.0)0.5M10ul1mMAprotinin1mg/ml25ul5ug/mlPepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml50ul10ug/mlLeupeptin5mg/ml100ul0.1mg/mlBenzamidine100mM250ul5mMNaF5M250ul250mMNaVO4(FW183.8)0.2M25ul1mM注意：*代表必须加的试剂细胞裂解缓冲液培养细胞用：。配制溶液，保存在°C 冰箱中。配制细胞裂解液（现用现配）：将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合，然后加入溶液，使其浓度为。（3）RIPA（组织样品）：1XPBS,1%NP-4O,0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS。（蛋白抑制剂在提取蛋白时现加，按 10ul/mlRIPA 的量加 10mg/mlPMSF，Aprotinin 按 30ul/mlRIPA 的量加入）也 可 用 样 品 裂 解 液 ： （ 2%SDS ； 0.01% 溴 酚 兰 ； 10% 甘 油 ； 60mmol/LTris-HCl（PH6.8）；100mmol/LDTT（取自-20C 存放的 1mol/L 储存液，临用时加入）2. 细胞裂解步骤将所有的样品放在冰上2/61.4C 离心 5min 沉淀细胞2.去掉上清3.将细胞重悬于 lml 冰冷的 PBS 中，转到离心管中4.4°C 离心 5min,（除去样中微量血清）5.除去上清6.置细胞沉淀于冰上7.每 107cells 加裂解工作液 100u1,轻轻重悬细胞沉淀8.置冰上 20min9.13000rpm 离心 15min,4C10. 将上清转到小离心管中（将管盖扎上针孔）11. 取出，用于测定12....