鸡胚成纤维细胞T7噬菌体文库的构建

工程学等领域，进展成为一门重要的生物技术，并取得顯著成就。T7 噬菌体是裂解性噬菌体，在细胞质中完成组装后，成熟的噬菌体直接通过细胞裂解而释放。不像丝状噬菌体系统，展示在 T7 表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广。另外，T7 噬菌体生长迅速、复制速度快、克隆效率高以及稳定的特性，使之成为替代其他传统系统的更好选择。为此，我们拟构建鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体表达文库，以期从中筛选出不同病毒的相关受体，为进一步讨论鸡胚成纤维细胞蛋白相互作用提供了实验讨论平台。一、材料与方法1.试验材料T7Select10-1b® Cloning Kit （Novagen 公司），鸡胚成纤维细胞 cDNA：由本实验室制备和保存。2.鸡胚成纤维细胞 cDNA 与 T7 受体臂的连接在无菌的 1.5mL 管中混合 cDNA 片段与 T7 受体臂，然后轻轻地用移液器枪头上下吹打混匀，于 16℃孵育 12～16h。贮存于 4℃，备用。3.鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体文库的体外包装向以解冻的 25µL T7 选择性包装提取物中加入 5µL 连接反应产物，室温孵育 2h 后，再加入 270µL 无菌 LB 液体培育基，终止反应。4.鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体原始文库的测定5.鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体文库的扩增及滴度的测定本实验选用平板法对文库进行扩增。首先将过夜培育的宿主菌按 2%的接种量接种 50 mL LB 液体培育基中，37℃振荡培育至 OD600=0.6～1.0，贮存于 4℃，备用。最后通过噬菌斑测定扩增后文库的滴度（同原始文库滴度测定）。6.鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体文库的序列测定取上述随机选择的 10 个阳性克隆噬菌斑 PCR 产物，送至上海生物技术服务有限公司测序。测序结果 NCBI 进行比对，鉴定其与鸡基因全序列的同源性。二、结果与分析1.鸡胚成纤维细胞 cDNA T7 噬菌体原始文库的滴度鸡胚成纤维细胞体噬菌体原始文库在倍比稀释度为 10-3 时的噬菌斑个数约 100（图1），在稀释度为 10-4 时的噬菌斑个数为 11（图 2），代入公式：稀释倍数×10×板上噬菌斑的数量，计算得鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体原始文库的滴度为 1.1×106pfu/ mL。2.鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体文库的重组子鉴定随机选择 10 个噬菌斑，用 T7seleetUP/DOWN 引物进行 PCR 检测重组子比例，重组子为6 个，占 60%，即鸡胚成纤维细胞 cDNA 文库重组率为 60%。3.鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体文库扩增后的滴度扩增后的鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体文库稀释度为 10-7 时的噬菌斑个数约为 200，在稀释度为 10-8 时的噬菌斑个数为 18，经计算得扩增后的鸡胚成纤维细胞 T7 噬菌体文库滴度为 1.8 ×1010 pfu/mL。三、讨论