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酶促反应动力学实验

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酶动力学综合实验实验(一)——碱性磷酸酶值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响2.了解米氏方程、值的物理意义及双倒数作图求值的方法。【实验原理】1、碱性磷酸酶:碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中,其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶,而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。2、米氏方程: 在讨论底物浓度与酶促反应速度的定量关系时,导出了酶促反应动力学的基本公式,即: (1)式中:v 表示酶促反应速度, 表示酶促反应最大速度, [S]表示底物浓度, 表示米氏常数。3、 值的测定主要采纳图解法,有以下四种: ① 双曲线作图法(图 1-1,a)根据公式(1),以 v 对[s]作图,此时 1/2时的底物浓度[s]值即为值,以克分子浓度(M)表示。这种方法实际上很少采纳,因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值,因而 1/2不精确。此外由于 v 对[S]的关系呈双曲线,实验数据要求较多,且不易绘制。 ② 作图法双倒数作图法(图 1-1,b)实际工作中,常将米氏方程(式(1))作数学变换,使之成为直线形式,测定要方便、精确得多。其中之一即取(1)式的倒数,变换为 方程式: (2)以 对 作图,即为形式。此时斜率为,纵截距为。把直线外推与横轴相交,其截距相交,其截距即为—。 ③ 作图法(略)把(2)式等号两边乘以,得: (3)以 v 对作图,这时斜率为,纵截距为,横截距为。④ 作图法(略)把(2)式等号两边乘以[S],得: (4)以对[s]作图,这时斜率为,纵截距为。 (a) (b)本实验主要以双倒数法,即 作图法来测定碱性磷酸酶值。具体原理如下:本实验以碱性磷酸酶为例,用磷酸苯二钠为其作用物,碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸,在适宜条件下(10.0,和 60℃),准确反应 13 分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物,以波长 620 比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下: 然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度,即以光密度的倒数作纵坐标,以底物浓度的倒数作横坐标,按 作图法来测定碱性磷酸酶值。【仪器与试剂】仪器:1. 恒温水浴2. 721 型分光光度计试剂:1. 酚试剂:称钨酸钠(W ·2 O)100g,钼酸钠(·2O)25g 置 1500 磨口回流装置内,加蒸馏水 700,85%磷酸50 和浓硫酸 100。充分混匀,使其溶解。小火加热,回流10h(烧瓶内加小玻璃...

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