Brdu-细胞增殖检测实验

Brdu 细胞增殖检测实验(15 页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Brdu 检测细胞增殖实验实验操作:1．铺细胞，每个 3.5cm dish 10 万个，在37℃、5%CO2孵箱中培育 72h（细胞密度至50-60%左右）。2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培育细胞中，1mg/ml，标记 48h。(量：Brdu 以铺满整个 dish 底面为准。)3．固定：PBS 洗细胞爬片 3 次，每次 5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA 固定 30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用 PBS 洗 3 次，每次 5min，2mol/L 的 HCl 在 37℃条件下变性 5min，可放置于 37℃恒温孵箱，应用封口膜把培育皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L 的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS 洗 3 次，每次 5min。（50r/m）6． 加入 1ml 的 0.2%TritonX-100，10min。7．吸出 TritonX-100，用 PBS 洗 3 次，每次5min。8．加入 1ml 3%的 BSA 封闭，室温 1h，可在摇床上晃动。9．吸出 BSA，用 PBS 洗 3 次，每次 5min。10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷 Brdu（鼠单抗）1:200），用 1%BSA 稀释，4 度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用 PBS 洗 3 次，每次 10min。12．加二抗（羊抗鼠 IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用 1%BSA 稀释，避光室温孵育 1h。（60 r/min）13．将孵好二抗的细胞爬片用 PBS 洗 3 次，每次 10min。14．加 DAPI 染细胞核，储存浓度为 1mg/ml，应将 DAPI 完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为 1:1000（用 PBS 稀释），避光室温反应 10min。15．将 DAPI 染好的细胞爬片用 PBS 洗 3 次，每次 10min。16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取 5 个视野，计数 Brdu 阳性细胞和蓝染的细胞核数目，然后进行统计分析。试剂配制：a. Brdu 的溶解：室温下，将 250mg 粉末溶于2.5ml 的 DMSO 中，储存浓度为 100mg/ml 分装，每管120ul，-20℃保存。b. 2 mol/L HCl：取 8.333mL 12 mol/L HCl的浓 HCl，加入 DDW 定容至 50 mL。c. 0.1 mol/L 硼酸钠：称量 1.907g 硼砂（Na2B4·10H2O 381.36 g/mol），加入 DDW 定容至 50 mL，调PH=8.3。d. 0.2% Triton X-100：有 0.5%的 Triton-100（2.5 mL 原液溶解于47.5 mL 的 PBS 中），用PBS 稀释至 0.2%。e. 3% BSA：称量 1.5g BSA，溶解于 50 mL的 PBS 中。f. 1% BSA：用 PBS 稀释 3%BSA 至 1%。g...