pcr 实验原理及注意事项(13 页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。PCR 疑难解答当 PCR 结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 将 PCR 反应的试管与反应板紧贴。 当酶反应混合物以 70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后略微振荡一下，因为在 0.2-ml的 PCR 管中不能均匀传热。 不要随意减少 dNTP 的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。 对于有问题的 PCR 反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加 Taq 酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常 PCR 扩增。 没有扩增产物： 在提供 MgCl2 缓冲液中，以 0.25mmol/L 为梯度增加 MgCl2 浓度；无 MgCl2 的缓冲液以 0.5 mmol/L 为梯度增加 MgCl2 浓度。 泳道中出现模糊条带，假如 DNA 模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加 MgCl2，因为在PCR 反应中可能缺少游离的 Mg2+。 检查退火温度和变性条件，假如有需要的话，可降低退火温度。 检查模板和引物的用量。 增加循环次数和/或模板 DNA 的用量。 泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板 DNA 的用量。 提高退火温度，但不要超过 68℃。 重新设计引物或设计更长的引物。 其他值得注意的条件： 建议使用 0.2-ml 薄壁管。厚壁管在 92℃时不能有效地使模板变性。 最佳反应体积为 50ml，推举用 30ml 矿物油覆盖（对盖子加热的 PCR 仪可以不加）。 大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 建议使用 1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP 或 2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化 Mg2+的浓度是必需的。 基因组 DNA 模板的质量显著影响 PCR 反应。因此推举使用琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA 的长度。DNA 片段长度可以超过 50kb，传统的DNA 能扩增片段至 10kb。 要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量 DNA 提取操作过程相关文献。 降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段 PCR 扩增时，引物长度一般为 24~34个核苷酸，溶点在 60~68℃间。使用这类引物可提高 PCR 反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。 变性：第一步变性在 94℃下进行 2 分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30 秒），除...
