Q-PCR 实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开 15-20 分钟。②超净台前做实验，需佩戴洁净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA 抽提需带罩。③取 EP 管倦头时需用镶子，不可以用使用过的手套直接取用。取完 EP 管倦头后，袋子及时封好。④橡 胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇活洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带罩不要在超净台前讲话。二、总 RNA 抽提1） 细胞培育血中细胞样品用 1*PBS 洗两次后，用 1ml 枪将 PBS 吸洁净，加入 1ml Trizol （Invitroged 溶液，吹打混匀，并吸至 L5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置 5min ；组织样品用液氮充分研磨，加入 1ml Trizol （ Invitroged 溶液，混匀，室温放置 5min 使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入 2 H 氯仿，剧烈振荡混匀 30s,使水相和有机相充分接触，室温静置 3-5min ；（离心、时离心、管按顺序排放，离心、完毕，离心、管的顺序也按顺序排好、与第一步的顺序一致）3）4C 下，14,0g 离心、15min,可见分为三层，RNA 在上层水相，移 至另一个新的RNase free EP 管；（用 20-2ul 的枪吸取上洁、吸上洁 时，枪头应沿着液面上层吸取上活，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀 RNA :加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒 6-8 次）（不 应用振荡器混匀），室温静置 10min;5）4C 下，14,0g 离心、10min,收集 RNA 沉淀（如离心后仍不见 EP 管 底部 有沉淀，应将 EP 管放置在-80 度冰箱过夜，继续在 4C 下，14,0g 离心、10min, 收藤 RNA 沉 淀），去上活；6）用 75%乙醇洗涤两次（12,0g 离心、5min ）（加入衣酿后只需轻轻颠倒EP 管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），jg 净台风十:沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留7）视沉淀量加入适量 DEPC 水（至少 15ul）溶解沉淀三、去基因组使用 RNase-free 的 DNase ? （ Promeg，按以下体系配置反应液，37C 消化 30min, 65C 灭活 10min。RNA30DNase ?2010 x buffer10H2O（RNase free）39.5RNasin0.5总体积 1然后按以下步骤操作：1）加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置 5min,后 14,0rpm,离心、15min,取上活。2 ）加入等体积的氯仿，...
