RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法

RNA 的提取和 cDNA 合成原理和实验方法第一节.概述从真核生物的组织或细胞中提取 mRNA，通过酶促反响逆转录合成 cDNA 的第一链和第二链，将双链 cDNA 和载体连接，然后转化扩增，即可获得 cDNA 文库,构建的 cDNA 文库可用于真核生物基因的构造、表达和调控的分析；比拟 cDNA 和相应基因组 DNA 序列差异可确定含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之 cDNA 的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的根本手段。自70 年代中叶首例 cDNA 克隆问世以来，已开展了许多种提高 cDNA 合成效率的方法，并大大改良了载体系统，目前 cDNA 合成试剂已商品化。cDNA 合成及克隆的根本步骤包括用反转录酶合成 cDNA第一链，聚合酶合成 cDNA 第二链，参加合成接头以及将双链 DNA 克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。一.RNA 制备模板 mRNA 的质量直接影响到 cDNA 合成的效率。由于 mRNA 分子的构造特点，容易受 RNA 酶的攻击反响而降解，加上 RNA 酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止 RNA 酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在 RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并常常更换〔使用一次性手套〕。所用的玻璃器皿需置于枯燥烘箱中 2T 烘烤 2 小时以上。但凡不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用 0. 1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净°DEPC 是 RNA 酶的化学修饰剂，它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反响而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。试验所用试剂也可用 DEPC 处理，参加 DEPC 至 0.1%浓度,然后剧烈振荡 10 分钟，再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的 DEPC，否则 DEPC 也能和腺嘌吟作用而破坏 mRNA 活性。但 DEPC 能与胺和巯基反响，因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理。Tris 溶液可用 DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌，可用 DEPC 处理水配制，并尽可能用未曾的试剂。除 DEPC 夕卜,也可用异硫氯酸胍、机氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了防止 mRNA 或 cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。细胞总 RNA 制备方法很多，如异硫氯酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总 RNA 提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总 RNA。别离的总...