中性粒细胞分离实验步骤

中性粒细胞分离实验步骤(2页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。一、中性粒细胞初步分选试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、RP1640、15ml 离心管 4 支，棉球，止血带、碘伏、采血针，5mlEDTA 抗凝采血管 2 支。1ml 枪及枪头。分离步骤：1. 所有试剂恢复至室温；2. EDTA 抗凝采血管收集人外周血 10ml;3. 分别将 5ml 外周血加入 5ml 人淋巴细胞分离液中（15ml 离心管中进行）；注意动作轻柔缓缓加入；4. 500g 离心，30-35 分钟，室温；5. 离心后收集低带中性粒细胞，分两层，第一层为单核细胞，第二层为中性粒细胞；（若离心后分层不明显则多离心 5-10 分钟）6. 将 RP1640 用纯水稀释为 50%RP1640 用于重悬中性粒细胞，恢复细胞活性。（5-10 分钟）7. 400g 离心 10 分钟，去上清，收集中性粒细胞，重悬于 RP1640 中，细胞计数。 二、中性粒细胞磁珠分选试剂耗材及设备：磁力分选器，磁柱，CD15 磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1640，1ml 枪及枪头，20 微升枪与枪头，15ml 离心管 4 支，细胞计数板。步骤：1. 制冰，保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在 4-8℃内进行分选；2. 配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS 液中含 2mmol/L EDTA，0.5%BSA，PH=7.2）；3. 将上步初步分选的中性粒细胞悬液 300g 离心 10 分钟，去上清；4. 细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，107细胞重悬于 80 微升缓冲液中；（如细胞数多按倍数增加）5. 107细胞中加入 20 微升 CD15 磁珠；充分混匀放入 2-8℃避光孵育 15 分钟；6. 用 1-2ml 缓冲液洗涤细胞/107细胞，300g 离心 10 分钟，去上清；7. 重悬细胞于缓冲液中，108细胞重悬于 500 微升缓冲液中；8. 将磁力分选器置于冰盒中，用 3ml 缓冲液冲洗磁柱；9. 将含有中性粒细胞的缓冲液加入磁柱中；10.用缓冲液冲洗磁柱，每次 3ml，冲洗 3 次；11.除去磁场，把磁柱放置于 15ml 离心管上，用 5ml 缓冲液加压快速冲洗磁柱；12.离心管中收集的便是中性粒细胞；13.300g 离心去上清，重悬细胞于 10ml 细胞培育液中，细胞计数。三、细胞活力检测步骤：1、4%台盼蓝：称取 4g 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加至 100ml，用滤纸过滤 4 度保存。使用时。用 PBS 稀释至 0.4%。2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。3、染色：细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9:1 混合混匀。（终浓度 0.04%）4、计数：在三...