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干扰载体构建SOP(16 页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。shRNA 干扰载体构建 SOP目录第一部分 RNA 干扰原理及 shRNA 设计 4第二部分 酶切与回收7第三部分 退火与连接9第四部分 转化与涂平板11第五部分 挑菌与菌液 PCR 13第六部分 质粒提取 15第一部分 RNA 干扰原理及 shRNA 设计标准操作规程(SOP)1. 目的：了解 RNA 干扰原理，设计 shRNA 干扰序列2. 仪器与设备：需要能够连接 Internet 的个人计算机，引物设计相关软件(如 Primer Premier 5)。3. 操作步骤3.1 RNA 干扰原理1) RNAi 概述： RNA 干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA 诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同源的双链 RNA 时，该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。由于 RNAi 具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的讨论工具。RNAi 技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。2) RNAi 原理：RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，小分子 RNA 被切割为 21-23 核苷酸长的小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为 Dicer的酶，是 RNase III 家族中特异识别双链 RNA 的一员，它能以一种 ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链 RNA，形成 19-21bp 的双链 RNAs(siRNAs)，每个片段的 3’端都有 2个碱基突出。在 RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将小分子 RNA 解双链的过程。激活的 RISC通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录体上，并在距离 siRNA 3’端 12 个碱基的位置切割 mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的 RNA 酶。3) RNAi 示意图(见图 1)3.2 shRN...