shRNA 干扰载体构建 SOP目录第一部分 RNA 干扰原理及 shRNA 设计4第二部分 酶切与回收 第三部分 退火与连接 第四部分 转化与涂平板 第五部分 挑菌与菌液 PCR 第六部分 质粒提取 第一部分 RNA 干扰原理及 shRNA 设计标准操作规程(SOP)1.目得:了解 RNA 干扰原理,设计 shRNA 干扰序列2.仪器与设备:需要能够连接 Internet 得个人计算机,引物设计相关软件(如 Primer Premier 5)。3.操作步骤3.1 RNA 干扰原理1)RNAi 概述: RNA 干扰(RNA interference, RNAi)就是指在进化过程中高度保守得、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发得、同源 mRNA 高效特异性降解得现象。简单得说就是指一种分子生物学上由双链 RNA 诱发得基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA 编码区同源得双链 RNA 时,该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默,就是一种特异性得转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。由于 RNAi 具有高度得序列专一性与有效得干扰,可以特异地将特定得基因沉默,从而获得基因功能丧失或基因表达量得降低,因此可以作为功能基因组学得一种强有力得讨论工具。RNAi 技术可广泛应用到包括功能学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等。2)RNAi 原理:RNA 干扰包括起始阶段与效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段,小分子 RNA 被切割为 21-23 核苷酸长得小分子干扰 RNA 片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明;一个称为 Dicer 得酶,就是 RNase III 家族中特异识别双链 RNA 得一员,它能以一种 ATP 依赖得方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入得双链 RNA,形成 19-21bp 得双链 RNAs(siRNAs),每个片段得 3’端都有 2 个碱基突出。在 RNAi 效应阶段,siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物(RNA-induced silencing plex, RISC)。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖得将小分子 RNA 解双链得过程。激活得 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录体上,并在距离 siRNA 3’端 12个碱基得位置切割 mRNA。尽管切割得确切机制尚不明了,但每个 RISC 都包含一个 siRNA与一个不同于 Dicer 得 RNA 酶。3)RNAi 示意图(见图 1)3.2 shRNA 设计1)shRNA: 即 short hairpin RNA(短发卡 RNA) ,包含两个短反向重复序列(其中一个与目得基因互补),中间由一个 loop 序...
