冰冻切片实验步骤

全部实验步骤1 取新奇组织于 4%多聚甲醛固定 24 小时2 30%蔗糖脱水 48 小时以上3 -250C 包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤1. 冰冻切片 4um 左右，室温 25°C 复温 30min，浸入 4°C 预冷的丙酮固定 10min，2. PBS（PH 为 7.2-7.4）在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次，每次 5min（第一次冲洗时间短些，约1min 后更换）3. 用 30%过氧化氢一份，纯甲醇 50 份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。4. PBS（PH 为 7.2-7.4，酸性）在 9cm 皿内摇床冲洗 3 次，每次 5min（第一次冲洗时间短些，约 1min 后更换），甩去 PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持 5mm 左右距离，太近会导致边缘效应。5. 5%BSA，室温孵育 20min，期间注意观察，以免 BSA 干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。6. 甩去血清，PBS 洗 1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。7. 配置一抗工作液用 5%BSA（抗体浓度为 1:100），悬空加入一抗工作液 50-100ul，枪头不 要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。8. 放入湿盒内，置于 4°C 冰箱过夜（最长不可超过 48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用 PBS 清洗浸泡。9. 第二天上午取出玻片，置常温复温 30min，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min，10. 滴加 1:100 生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在 EP 管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育 30min-1h，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min。11. 滴加 1:100 比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素 PBS 稀释液（SABC）室温1h，后 PBS 冲洗 1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。12. DAB 显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止 DAB 反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加 DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间 2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）13. 终止 DAB 显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止 5min，后在显微镜下观察是否有 DAB 颗粒附...