13-毕氏酵母感受态细胞制备及转化VIP专享

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350 可屏蔽高浓度 LiCl 的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种 Pachia pastoris 到 50ml YPD 培育基中，30℃摇菌过夜（约 24～28h）培育到 OD值为 0.8～1.0（约 108 Cells/ml）；收获细胞，用 25ml 无菌水洗涤一次，室温下 1500g 离心 10min；重悬细胞于 1ml 100mM LiCl 溶液中，将悬液转入 1.5ml 离心管；离心机最大速度离心 15 秒沉淀菌体，重悬菌体于 400ul 100mM LiCl 溶液中；按 50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸 1ml 鲑鱼精 DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体 DNA；将感受态酵母菌离心，以 Tips 去除残余的 LiCl 溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链 Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒 DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约 1min）；30℃水浴孵育 30min；42℃水浴热休克 20～25min;6000～8000rpm 离心收集酵母菌体；重悬酵母于 1ml YPD 培育基，30℃摇床孵育；1～4h 后，取 25～100ul 菌液铺选择性培育基平板，于 30℃培育 2～3 天鉴定；2、毕氏酵母 PEG1000 转化法 （1）试剂缓冲液 A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol缓冲液 B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液 C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新奇、试剂级 DMSO，-70℃保存注：缓冲液 A、B、C 均用滤膜过滤，-20℃保存;将 DNA 直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源 DNA 的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按 6 样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种 Pachia pastoris 于 YPD 平板，30℃培育 2d;挑取单克隆酵母菌株于 10mlYPD 培育基中，30℃振荡培育过夜；取步骤 2 中小量菌液接种到 100mlYPD 培育基...