DNA浓度和纯度的测定

DNA 浓度和纯度的测定一、原理DNA 或 RNA 链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm 处.波长为 260nm 时，DNA 或 RNA 的光密度 OD260 不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为 1μg / ml 时，DNA 钠盐的 OD260＝0.02当 OD260＝1 时，dsDNA 浓度约为 50μg / ml ssDNA 浓度约为 37μg / ml RNA 浓度约为 40μg / ml 寡核苷酸浓度约为 30μg / ml（youyu 底物不同有差异）当 DNA 样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响 DNA 吸光度的准确测定.一般情况下同时检测同一样品的 OD260、OD280 和 OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯 DNA:OD260 / OD280≈1。8 （＞1.9,表明有 RNA 污染；＜1。6,表明有蛋白质、酚等污染） 纯 RNA:1。7 ＜OD260 / OD280＜2.0 （＜1。7 时表明有蛋白质或酚污染；＞2。0 时表明可能有异硫氰酸残存)若样品不纯，则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算. 二、材料、试剂及器具1、 材料提取的 PUC19 样品、PUC19 标准样品2、 试剂灭菌重蒸水，TE 缓冲液3、 器皿石英比色皿；UV—240 紫外分光光度计二、实验步骤1、 UV—240 紫外分光光度计开机预热 10min。2、 用重蒸水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入 TE 缓冲液后，放入样品室的 S 池架上，关上盖板。3、 设定狭缝后校零.4、 将标准样品和待测样品适当稀释（DNA 5μl 或 RNA 4μl 用 TE 缓冲液稀释至 1000μl）后，记录编号和稀释度。5、 把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的 S 架上，关闭盖板。6、 设定紫外光波长，分别测定 230nm、260nm、280nm 波长时的 OD 值.7、 计算待测样品的浓度与纯度。DNA 样品的浓度（μg / μl):OD260×稀释倍数×50/1000RNA 样品的浓度(μg / μl)：OD260×稀释倍数×40/1000方案二 溴化乙锭法一、原理溴化乙锭（EB）是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA 或 RNA 链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA 吸收 254nm 的紫外辐射并传递能量给 EB，而 EB 本身在 302nm和 366nm 处有光吸收.吸收的能量在 590nm 处释放，并表现为橙红色荧光。结合的 EB 的荧光产率远大于游离 EB 的荧光产率。EB 结合量的多少与 DNA 的大小和构型有关，而荧光强...