RT-PCR原理和实验步骤

RT-PCR 原理与实验步骤 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个 mRNA 存活 4d，可以合成 105个丝心蛋白） 共合成 109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR 技术(Polymerase chain reaction）：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A。变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA;B。退火:将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合. C.延伸:在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2＋存在下，退火引物沿 5’ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复. 3、逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链; 2、Rnase 水解活性：水解 RNA：DNA 杂合体中的 RNA； 3、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA。 二、RT-PCR 的准备：1.引物的设计及其原则： 1) 引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2) 引物设计原则的把握引物设计原则包括 ：a、引物长度:一般为 15～30bp ，引物太短会影响 PCR 的特异性，引物太长 PCR 的最适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避开嘌呤或嘧啶的聚集存在,特别是连续出现 3 个以上的单一碱基.GC 含量(Tm 值）:40%～60％，PCR 扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去 5~10 度。 c、 3’ 端要求：3’ 端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低，G、C 居中间,因此引物的 3’端最好选用 A、G、C 而尽可能避开连续出现两个以上的 T. d、引物自身...