流式细胞术的原理和应用VIP免费

细胞因子及免疫细胞功能检测方法简介刘素侠山东大学医学院免疫学研究所2011-2-23内容细胞因子检测的常用方法免疫细胞功能的常用检测方法一、免疫学检测的基本原理•抗原与抗体反应的特异性是各种免疫学检测技术的基本原理二、细胞因子检测方法•细胞因子的临床意义•常规测定法•胞内细胞因子检测方法•细胞因子检测的主要临床应用（一）细胞因子的临床意义•细胞因子与疾病：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。•细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：IFN-α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的：IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等（二）常规检测方法•分子生物学测定法•生物活性检测法•免疫化学测定法1.分子生物学测定法•是测定细胞因子mRNA的表达水平，主要有两种方法：•分子杂交技术•多聚酶链反应技术（PCR）分子杂交技术•制备细胞因子的基因探针；•Northern杂交或细胞原位杂交；•优点：高度敏感和高度特异；•缺点：操作较繁琐测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。多聚酶链反应技术（PCR）•PCR（polymerasechainreaction)技术，是一种高效的基因体外扩增技术；•将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增；•优点：灵敏度高操作简便•缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。PCR原理•PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。•由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：dsDNAssDNA②退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对③延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新DNA链•新链又可成为下次循环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍5’3’5’3’变性退火延伸第二循环dsDNAssDNA加入引物5’3’3’5’dNTP,Taq酶5’3’5’5’3’3’3’5’5’3’5’5’反转录PCR（ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)RTPCRRT-PCR反应过程反转录PCR：mRNA---cDNA---PCR•抽提RNA•反转录合成cDNA•PCR扩增RT反应体系•模板：总RNA，mRNA•引物：随机引物，Oligo(dT)，基因特异性引物（GSP)•逆转录酶：AMVM-MLVQuantReverseTranscriptasePCR反应体系•模板：逆转录产物cDNA•目的基因特异性引物；•反应混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg++RT-PCR反应产物检测•凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性。•酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究。•分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变•核酸序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法实时荧光定量PCR(FluorescenceQuantifiedrealtimePCR)•与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。（1）原理•实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1)常用名词概念•扩增曲线•荧光阈值•Ct值扩增曲线设定荧光域值•PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号；•荧光域值的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold=10´SDcycle3-15•意义：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值，进入指数期的最初阶段；•真正荧光信号：荧光信号大于阈值荧光阈值（threshold）Ct值•Ct值的含义是：扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数C代表Cycle（循环数）t代表threshold（荧光域值）Ct值的确定横坐标：PCR循环数纵坐标：荧光信号强度黑线：荧光域值红线：无模板---域值下一直线绿线：样品Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多...