慢性阻塞性肺疾病患者支气管肺泡灌洗液细菌宏基因组DNA的制备VIP免费

ＲesearchPaper研究报告微生物学报ActaMicrobiologicaSinica54(8):943－949;4August2014ISSN0001－6209;CN11－1995/Qhttp://journals．im．ac．cn/actamicrocndoi:10.13343/j．cnki．wsxb．2014.08.013基金项目:北京大学医学部-密歇根大学医学院转化医学与临床研究联合研究所，转化医学-密西根项目(BMU20110176)*通信作者。Tel:+86-10-82265210;E-mail:puh3_hb@bjmu．edu．cn作者简介:王娟(1980－)，女，安徽省庐江人，助理研究员，博士，研究方向为分子生物学和微生物学。E-mail:wangjuand@126．com收稿日期:2013-11-25;;修回日期:2014-01-10慢性阻塞性肺疾病患者支气管肺泡灌洗液细菌宏基因组DNA的制备王娟1，3，沈宁1，3，杜毅鹏1，3，JohnＲErb-downward2，3，GaryBHuffnagle2，3，MargaretＲGyetko2，3，贺蓓1，3*1北京大学第三医院呼吸科，北京1001912密西根大学医学院内科呼吸与危重症医学科，美国3北京大学医学部-密歇根大学医学院转化医学与临床研究联合研究所，北京100191摘要:【目的】优化稳定期慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydiseases，COPD)患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluids，BALF)细菌宏基因组DNA的提取方法，以便于高效提取微量的细菌DNA进行后续的PCＲ反应和测序。【方法】取稳定期COPD患者的BALF5mL，离心收集细胞。为了有效提取样品中革兰氏阳性菌的基因组，对QIAGEN的DNA提取试剂盒的操作步骤进行优化:加入裂解缓冲液ATL后首先运用研磨珠和多功能生物样品匀质器破碎菌壁，再加入蛋白酶K孵育，然后加入裂解缓冲液AL振荡混匀。无水乙醇沉淀DNA后，将全部溶液过柱，用洗液AW1和AW2各洗柱一次，最后加50μL洗脱液洗脱DNA。提取的DNA定量后，运用PCＲ方法检测样本中的细菌16SrDNA量，并按照测序要求构建DNA文库进一步验证。【结果】试剂盒优化法提取的BALF的DNA总量为467.5(135.0－1697.5)ng，明显高于按照传统酚-氯仿法提取的DNA总量95.0(0－612.5)ng，并且所提取的DNA可以很好的扩增细菌的16SrDNA以及构建DNA文库，改良后的扩增产物明显增多(P=0.002)。【结论】使用DNA提取试剂盒结合研磨珠和多功能生物样品匀质器破菌壁的方法能够更高效的提取BALF中微量的宏基因组DNA，为进一步的测序和菌群分析打下基础。关键词:慢性阻塞性肺疾病，支气管肺泡灌洗液，宏基因组DNA中图分类号:Q93-3文章编号:0001-6209(2014)08-0943-07慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydiseases，COPD)是呼吸系统的常见病、多发病。其病理基础和核心环节是慢性气道炎症［1］。在COPD发展过程中，反复的急性加重严重影响患者的生活质量，并且是COPD患者发病率和死亡率升高的主要原因之一。细菌感染被认为是引起COPD加重的最重要的危险因素之一。近年来，细菌在稳定期COPD患者的下呼吸道定植已在国内外受到关注，越来越多的研究发现可能与COPD加重相关。因此，明确患者下呼吸道致病菌群对于认识JuanWangetal．/ActaMicrobiologicaSinica(2014)54(8)COPD疾病发展具有重要意义。一直以来，下呼吸道细菌的实验室检查主要依赖于痰和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluids，BALF)细菌培养。但由于环境中99.8%的微生物不能用常规的培养方法培养，细菌培养的结果未必能真实反映下呼吸道的菌群情况，苛养菌和不常见菌更是难以鉴别。利用非培养依赖的分子生物学方法对环境中的微生物进行研究可突破传统方法的限制。Handelsman等［2］于1998年提出的建立未培养微生物宏基因组文库的设想，把对未培养微生物的研究引入到一个新的层次，获取高质量的DNA是进行宏基因组研究的先决条件。BALF可以更好反映小气道细菌定植情况，但相较于其他标本，BALF中的细菌含量很低，因此如何高效的提取BLAF中微生物的宏基因组DNA并且避免外源细菌的污染是进一步明确菌群组成的关键步骤。本研究以COPD患者的支气管肺泡灌洗液为样本，用DNeasyBlood＆TissueKit(QIAGEN)试剂盒提取DNA并对其方法进行优化，可以有效提取BALF中微量的细菌DNA，并能够顺利创建测序所用的DNA文库，便于后续的454测序反应进行菌群分析。1材料和方法1.1材料1.1.1患者情况:受试者来自于2012年北京大...