超声对酵母细胞膜通透性的影响3卢群1,2刘晓艳1,3丘泰球1罗登林11(华南理工大学,广州,510640)2(广东药学院,广州,510224)3(仲恺农业技术学院,广州,510225)摘要用不同参数的变幅杆浸入式超声波作用酵母细胞,测定细胞内核酸、蛋白质及FDP(1,6-二磷酸果糖)3种物质渗出率,再用透射电镜观察细胞形态。探讨超声场对酵母细胞膜通透性影响的最佳参数及机理。结果表示,超声场的最佳参数是:电功率500W、脉冲时间3s、间隙时间4s、脉冲总时间共225s,影响酵母细胞膜通透性变化的主要机制是空化作用使细胞膜在一定程度上损伤产生穿孔效应,细胞膜的通透性提高。关键词超声,细胞膜,通透性第一作者:博士,讲师。3国家自然科学基金资助项目(批准号:10174021)收稿日期:2005-05-16细胞膜的重要功能之一是选择通透性。通过选择性地通透,细胞能接受或拒绝,保留或排出某种物质[1]。人为地改变细胞膜的通透性,可以改变原料的输入或代谢产物的排出速率,以利于代谢产物在细胞外的积累,使代谢朝着人们希望的方向进行,是实现代谢人工调控的重要方法之一。而常用方法是添加药物的化学法、反复冻结和解冻的物理法。目前应用较为广泛的是化学的传统法。其缺点是效率低,胞内物质释放率低,处理时间长,试剂用量大,成本高,同时后处理也有诸多不便。且由于化学试剂的毒性,进一步分离时需用透析等方法除去[2]。超声波法效率高,处理时间短,无化学试剂残留,更没有进一步除毒的必要。低频超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应,使细胞膜短时局部破裂,从而改变细胞质膜的通透性,使细胞内物质释放或细胞外物质进入细胞内。本文就是采用超声波来处理酵母细胞,观察其通透性的变化情况,在不同参数的变幅杆浸入式超声波条件下,分析细胞内核酸、蛋白质及FDP这3种物质的渗出率,并利用透射电镜观察对细胞分析及作用机制探讨。1材料与方法1.1材料与仪器酵母(Saccharomycescerevisiae),活性干酵母,梅山马利;微量取液器,北京青云航空仪表有限公司;752紫外分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;灭菌锅,上海三申;恒温振荡器,THZ-C,江苏太仓市实验设备厂;电动离心机80-2,上海悦丰仪表有限公司;变幅杆浸入式超声波处理机,JY922Ⅱ,上海新芝生物技术研究所;透射电镜,FEI2Tecnai12,日本电子。1.2实验方法1.211细胞培养将酵母接种到发酵培养基(C6H12O6,0155mol/L、Na2HPO4,012mol/L、NaH2PO4,012mol/L、MgCl2,0101mol/L)中,温度为3715～3815℃,摇床转速120r/min,发酵时间为1d。11212超声处理将发酵液放置于冰水浴中,用超声处理。将处理后的发酵液继续发酵2h。发酵完毕后,取20mL发酵液于80℃的水浴中灭酶,剩余部分用于测细胞染色率。变幅杆浸入式超声的作用参数:频率20～25kHz,功率分别为600W,500W,400W,超声的作用时间为每次3s,间隔时间为4s,作用的总时间分别90、135、180、225、270s。容器的直径为:415cm。11213核酸,FDP和染色率测定核酸的测定参照文献[4]。FDP的测定参照文献[5]。细胞存活率的测定参照文献[6]。11214透射电镜观察将酵母接种到发酵培养基中,摇床转速120r/min,3715～3815℃发酵1h,分别进行如下处理:A:不做任何处理;B:变幅杆浸入式超声处理;B1:频率20～25kHz,功率为300W,每次3s,间隔时间为4s,作用的总时间分别90s;B2:频率20～25kHz,功率为500W,每次3s,间隔时间为12s,作用的总时间分别270s。将处理后的样品经戊二醛固定、纯812树脂包埋18h后用LKB27800型超薄切片机切片,然后用FEI2Tecnai12透射电镜观察,定位摄影。食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES142005Vol.31No.9(Total213)2结果211不同功率超声对细胞膜通透性的影响图1超声对核酸渗透的影响图2超声对蛋白质渗透的影响图3超声对FDP渗透的影响图1、图2、图3分别是测定发酵液中核酸、蛋白、FDP变化率的趋势曲线,也就是细胞外分泌物变化反映胞内变化趋势曲线。核酸(蛋白、FDP)提高率=[(处理后发酵液中核酸(蛋白、FDP)的含量/未处理发酵液中核酸(蛋白、FDP)的含量)-1]×100%存活率=细胞总数-死细胞总数细胞总数×%图1～图3表明,随着超声作用时间的增加,不同功率的超声都使胞内核酸、蛋白质及FDP的渗出浓度逐渐提高。其中600W超声的作用最为明显,500W次之,400W最差。超声...
