血清白球蛋白的离纯化及鉴定[整理后]VIP免费

血清白蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定分离纯化的一般程序选择材料破碎细胞提取分离纯化分析及鉴定（粗分级，细分级）（预处理）实验目的通过从血清中分离、纯化、通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白和鉴定血清白蛋白和γ-γ-球蛋白的实验，球蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能。质的技能。实验原理1.初分级初分级::血清经血清经饱和硫酸铵饱和硫酸铵盐析后获得白蛋盐析后获得白蛋白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。白粗分离样品和球蛋白粗分离样品。2.2.脱盐脱盐::用用凝胶色谱凝胶色谱法除去分离样品中的盐类法除去分离样品中的盐类。。3.3.细分级细分级::用用离子交换色谱离子交换色谱法从白蛋白粗分离法从白蛋白粗分离样品中提取纯化的白蛋白；从球蛋白粗分离样样品中提取纯化的白蛋白；从球蛋白粗分离样品提取纯化的品提取纯化的γ-γ-球蛋白。球蛋白。4.4.鉴定鉴定::用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。用醋酸纤维薄膜电泳进行鉴定。1.盐析原理:当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。•不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在半饱和硫酸铵溶液中，血清半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白球蛋白会沉淀，经会沉淀，经离心后，可与离心后，可与白蛋白白蛋白分离开。分离开。•影响因素：影响因素：PHPH、温度、蛋白质纯度等。、温度、蛋白质纯度等。•逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。操作操作一、盐析一、盐析－－白蛋白、－－白蛋白、γγ球蛋白的粗分离球蛋白的粗分离<1><1>取取0.5ml0.5ml血清血清<2><2>取取0.5ml0.5ml饱和饱和(NH(NH４４))２２SOSO４４溶液，溶液，缓慢滴入，缓慢滴入，边加边摇边加边摇。。<3><3>混匀后于室温中放置混匀后于室温中放置1010分钟。分钟。<4>8000r/min×10min<4>8000r/min×10min<5><5>小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。<6><6>沉淀加沉淀加0.5ml0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化蒸馏水，使之溶解，作为纯化γγ球蛋白用。球蛋白用。2.脱盐盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分，样品中含有过高的离子浓度离子成分，样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要离子交换层析进行细分级前需要脱盐脱盐。。凝胶色谱法是一个温和而又快速的凝胶色谱法是一个温和而又快速的脱盐方法，同时可将蛋白质转换到用于脱盐方法，同时可将蛋白质转换到用于离子交换层析的低离子强度缓冲液中。离子交换层析的低离子强度缓冲液中。凝胶过滤的原理洗脱液中蛋白质及盐分的检查取取9696孔板一块，上四排加孔板一块，上四排加2020％磺基水杨酸，％磺基水杨酸，下三排加下三排加BaClBaCl22液。液。从下端管口取从下端管口取11滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于2020％磺基水％磺基水杨酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，杨酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出，开始收集蛋白样品开始收集蛋白样品。。从下端管口取从下端管口取11滴洗脱液，滴于滴洗脱液，滴于BaClBaCl22中，出中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集不再收集。。二、G-25凝胶层析脱盐（一）葡聚糖凝胶（一）葡聚糖凝胶G-25G-25层析柱的制备层析柱的制备（二）上样与洗脱：11、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面刚好下降到凝胶床表面((注意不要使液面低于凝注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床胶床表面以致空气进行凝胶床))。。22、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上小心缓慢的加到凝胶床表面上((注意不要将凝胶注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整粒中...