抗肿瘤药物实验法VIP免费

抗肿瘤药物实验法安徽医科大学临床药理研究所2010.04.30在抗肿瘤研究中，人们提出了肿瘤多步骤、DNA突变、细胞凋亡、细胞周期核心机制、细胞周期启动及多条信号转导途径参与等许多理论和学说。抗肿瘤药的研究随着理论的更新和技术的进步，已从以核酸等为靶点的杀伤型细胞毒药转向对肿瘤新靶点的研究。包括化学预防药、分化诱导剂、凋亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、肿瘤耐药逆转剂、生物调节剂以及化放疗保护剂等。随着新型抗癌药的研究，诞生了许多抗肿瘤药物实验方法。第1节肿瘤细胞体外筛选方法一、抗肿瘤药体外方法动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要的作用，但动物模型费用高，周期长使其不适合大规模的抗肿瘤药物评价。因此抗肿瘤药初步筛选首先应采用肿瘤细胞体外实验方法，既节约成本又节省时间。1.MTT法【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜；而死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光度（OD值）。OD值与活细胞数成正比，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。•【操作步骤】（1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，5%～10%NBS的RPMI1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂对照，每组3-6平行孔。37℃，5%CO2、95%空气的培养箱中预培养24h，弃上清。（2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂常用的有二甲亚砜和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。（3）细胞连续培养24～72h，每孔加入10μl5mg/ml的MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。（4）吸去上清。加入200μlDMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。（5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100%2.XTT法【基本原理】XTT是MTT的衍生物，经过活细胞代谢还原成水溶性的代谢产物，代谢产物的量与活细胞的数目成正比，因此利用酶标仪在检测波长465nm处测定代谢物的OD值可以推测活细胞的数量。数据处理方法同MTT法。•【操作步骤】（1）细胞接种，药物处理均同MTT方法。（2）药物处理24～72h后，每孔加50μlXTT溶液（内含50μgXTT，5μl10mmol/L的电子偶联剂(PMS)）继续培养4h。（3）96孔培养板振荡2～3min后，直接用酶标仪在465nm波长处测OD值。【注意事项】（1）优点：XTT代谢产物溶解于水，不需要吸去上清就可测OD值，简单方便，减少误差。（2）XTT不易被线粒体酶还原，因此同时加入电子偶联剂(PMS)。（3）每孔的XTT量不宜加入太多，高浓度的代谢产物抑制线粒体酶活性。（4）XTT和PMS现用现配。3.染料排斥法检测药物对肿瘤细胞的生长抑制【基本原理】活细胞有排斥染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等染色的能力，而细胞死亡后由于膜完整性遭到破坏，细胞即被着色。【操作步骤】（1）25ml培养瓶中加入细胞4×104个、受试药40μl，终体积4ml，（2）5%CO2，37℃培养48～96h。（3）取细胞悬液0.4ml，加0.4%台盼蓝液0.1ml，在室温作用5min，在15min内，细胞计数板计数约200个细胞中死细胞（蓝色）的个数。【结果评定】（1）活细胞率%=（未染色细胞数/细胞总数）×100%。（2）将活细胞率与药物浓度的对数作图，可得到S形剂量反应曲线，计算半数杀伤浓度（LC50）。（3）当LC50<10μg/ml并能重复时，提示药物应进一步实验。【注意事项】药物杀伤细胞作用可能被低估原因：（1）存活细胞可能继续繁殖，使活细胞率增高。（2）死细胞可能过早地崩解，计数时已不存在，使死细胞率下降。4.集落形成法测定药物对肿瘤克隆原细胞的生长抑制作用【基本原理】克隆原细胞指具有持续增殖能力的细胞。当单个细胞能连续分裂6代或以上时，其后代所组成的群体（集落）含50个以上细胞。计数集落可以对克隆原细胞作定量分析。反映了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗肿瘤药物的活性，目前被认为是一种较理想的检测方法。常用的集落形成方法可分为贴壁法及半固体培养基法。•【操作步骤】（1）贴壁集落形成：适用于几乎所有贴壁生长的细胞。1）生长期贴壁细胞一瓶，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，活细胞计数，培养基稀释成50～100...