骨桥蛋白RGD黏附序列多拷贝短肽的表达、纯化及生物学活性测定VIP免费

http://www.paper.edu.cn-1-骨桥蛋白RGD黏附序列多拷贝短肽的表达、纯化及生物学活性测定1吴红玉，温进坤，韩梅河北医科大学生物化学与分子生物学研究室，河北省医学生物技术重点实验室，河北石家庄（050017）E-mail:wjk@hebmu.edu.cn摘要：目的：用大肠杆菌表达骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽，经分离纯化后检测其生物学活性。方法：运用基因重组技术，将骨桥蛋白RGD黏附序列的核酸片段首尾相连，与携带GST编码序列的原核表达载体连接构建融合蛋白表达质粒pGEX-3X-RGD。将重组质粒转化宿主菌后，对诱导融合蛋白表达的条件进行优化。表达产物GST-RGD经谷胱甘肽-亲和层析纯化后，分别检测其对骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移的影响。结果：所构建的含有6个拷贝短肽的GST-RGD融合蛋白可在大肠杆菌中以包含体的形式进行表达。用十二烷基肌氨酸钠变性溶解包含体及透析复性后，经亲和层析可得到高纯度的GST-RGD(6)融合蛋白。GST-RGD(6)融合蛋白能特异性的抑制骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞的黏附和迁移。结论：骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽可在大肠杆菌中高效表达，纯化的GST-RGD融合蛋白具有抑制血管平滑肌细胞黏附和迁移的活性。关键词：骨桥蛋白；GST-RGD融合蛋白；原核细胞表达；生物学活性中图分类号：Q256文献标识码：A当血管内膜受损时，位于血管中膜的血管平滑肌细胞（vascluarsmoothmusclecell,VSMC）在生长因子和细胞因子的刺激下由收缩表型转化为合成表型，并获得向内膜下迁移、增殖及合成和分泌大量细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）的能力[1]。已经发现,在新生内膜形成过程中,骨桥蛋白（osteopontin,OPN）mRNA的表达迅速上升,细胞外基质中的OPN含量也显著升高[2]，这说明OPN在诱导VSMC的黏附和迁移中发挥着重要作用。作为一种基质功能性蛋白,OPN既是合成型VSMC的重要标志,是其合成和分泌的量最大的一种细胞外基质成分，同时又是细胞黏附和迁移的分子基础。OPN分子中含有高度保守的细胞黏附序列，即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,简称RGD)序列，OPN通过此序列与多种类型细胞的整合素受体相互作用而调节细胞的黏附、迁移、增殖等多种生物学行为[3、4]。业已证实，含RGD序列的短肽能够竞争性的抑制OPN与整合素受体的结合[5]，从而抑制VSMC以及炎性细胞的黏附和迁移。因此，这些小分子肽在预防和治疗动脉粥样硬化、PTCA术后再狭窄等血管重塑性疾病方面具有重要的应用前景。但是，目前小分子肽主要靠人工化学方法合成，因价格昂贵而限制了其广泛应用。为此，我们利用基因重组技术，将含有编码RGD序列的cDNA片段与携带谷胱甘肽S-转移酶（GST）编码序列的原核表达载体进行重组，构建RGD多拷贝重组子，将其转化大肠杆菌表达GST-RGD融合蛋白，经分离纯化后获得GST-RGD纯品，为研究RGD多拷贝短肽在防治VSMC黏附和迁移中的作用奠定了实验基础。1.材料与方法1.1材料原核表达质粒pGEX-3X、E.coliDH5α菌株为本室保存，SD大鼠由河北省实验动物中1本课题得到国家自然科学基金项目(30570661)，高等学校博士点基金（20040089018）和河北省自然科学基金项目（C2006000814）的资助。http://www.paper.edu.cn-2-心提供，限制性内切酶BamHI，EcoRI，BglⅡ购自TaKaRa生物制品公司，pGEMTM-T载体试剂盒、GST-Sepharose4B购自Promega公司，还原型谷胱甘肽购自Roche公司。1.2含RGD13肽的核苷酸序列设计正义链：5’-GCTCGGATCCTCATGGGCCGAGGTGATAGTGTGGTTTATGGACTG-3’；反义链：5’-ACTCGAATTCCGCTAAGATCTCATTTTTGACCTCAGTCCATAAAC-3’。在编码13肽的核苷酸序列5’端引入BamHI酶切位点，3’端引入BglⅡ酶切位点、终止密码子和EcoRI酶切位点（核苷酸序列中的画框部分），下划线部分为编码RGD13肽的核酸序列，利用BamHI和BglⅡ互为同尾酶的特性实现13肽核酸片段的多拷贝串联。1.3PCR补齐核酸片段将合成的两条核酸片段以自身作为引物和模板，经聚合酶链式反应进行末端补齐。反应体系：两条片段各取1µg,TaqDNA聚合酶10U，10mmol/LdNTP1µl，10×TaqDNA聚合酶缓冲液10µl，加双蒸水至100µl。PCR循环参数：94℃1min，94℃45s,28℃45s,72℃45s,6个循环；94℃1min，94℃45s,55℃45s,72...