第10卷第4期中华男科学Vol.10No.42004年4月NationalJournalofAndrologyApr.2004·论著·淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜佐剂的融合表达潘静,毛旭虎,张卫军,鲁东水,罗萍,王宁(第三军医大学医学检验系,重庆400038)摘要:目的:在大肠埃希菌(E.coli)中表达淋病奈瑟菌外膜蛋白与粘膜免疫佐剂的融合蛋白。方法:PCR扩增淋病奈瑟菌保守抗原表位porinloopⅥ～Ⅷ(PL678)基因,并与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合,转化E.coli,ELISA、SDS2PAGE及Western印迹分析其表达。结果:融合蛋白获得表达,具有结合GM1神经节苷酯的能力和与抗淋病奈瑟菌多克隆抗体的反应性。结论:融合蛋白的表达为研究淋病奈瑟菌分子内佐剂疫苗奠定了基础。关键词:淋病奈瑟菌;不耐热肠毒素B亚单位;融合表达中图分类号:R339.2+1文献标识码:A文章编号:100923591(2004)0420269204FusionExpressionofNeisseriagonorrhoeaeOutmembraneProteinwithaMucosalAdjuvantPanJing,MaoXuhu,ZhangWeijun,LuDongshui,LuoPing,WangNingCollegeofMedicalLaboratory,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China(PanJ,MaoXH,ZhangWJ,LuDS,LuoP,WangN)Correspondenceto:MaoXuhu,E2mail:clinimmu@mail.tmmu.com.cnAbstract:Objective:ToexpressafusionproteinofNeisseriagonorrhoeaewithamucosaladjuvant.Methods:ThegenecodingLoopⅥ2Ⅷ(PL678)ofporin,anout2membraneproteinofNeisseriagonorrhoeae,wasobtainedbyPCR.ItwasinsertedintoaplasmidfusedwithsubunitBofheatlabileenterotoxin.TherecombinantwastransformatedinE.coli.TheexpressionoffusionproteinwasanalysedbyELISA,SDS2PAGEandWestern2blot.Result:FusionproteinwithLTBwassuccessfullyexpressed,anddisplayedboththeabilityofbindingGM1andthereactogenicitywithpolyclonalantibodiesagainstNeisseriagonorrhoeae.Conclusion:TheexpressionoffusionproteinlaidafoundationforthestudyoftheintramolecularvaccineagainstNeisseriagonorrhoeae.NatlJAndrol,2004,10(4):2692271,274Keywords:Neisseriagonorrhoeae;subunitBofheatlabileenterotoxin;fusionexpression淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae,Ng)是淋病的致病菌,疫苗对于预防控制淋病的流行传播具有十分重要的意义1。本研究拟应用分子设计的理论和基因重组技术通过分析Ng具有保护作用的抗原表位porinloopⅥ～Ⅷ(PL678)的分子结构,克隆其基因,并与强力、无毒的粘膜免疫佐剂不耐热肠毒素B亚单位(subunitBofheatlabileenterotoxin,LTB)按适当空间结构在大肠埃希菌(E.coli)中融合表达呈免疫优势/显性,为研制和开发淋病分子内佐剂基因工程疫苗奠定基础。1材料与方法1.1材料E.coliDH5α、JM109菌株为本室保存菌种,LTB羧基末端融合表达载体pLV2.0由本室构建。各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA·962·收稿日期:2003202219;修回日期:2003212210基金项目:重庆市应用基础研究课题(200026321)作者简介:潘静(19682),重庆市人,实验师,硕士研究生,从事临床检验专业。通信作者:毛旭虎,E2mail:clinimmu@mail.tmmu.com.cn连接酶均购自华美生物工程公司;IPTG、GM1神经节苷脂为Sigma产品,其他化学试剂均为分析纯。兔抗LT多抗血清购自上海市卫生防疫站,抗Ng阳性血清采自临床Ng感染患者。1.2方法1.2.1基因组DNA、质粒提取、DNA片段回收纯化采用Sangon公司UNIQ10小量质粒抽提试剂盒和SilverBeads胶回收试剂盒。1.2.2DNA酶切反应、连接、转化按文献2进行。1.2.3SDS2PAGE和Western印迹采用Bio2Rad电泳系统,5%样品胶,12%分离胶,TAE电泳缓冲液。电泳完后,一部分考马斯亮蓝染色,UVP扫描;另一部分电转移(40mA,2h)至硝酸纤维膜上,TBST封闭,4℃过夜;加入一抗(Ng感染患者阳性血清),37℃温育1h,TBST洗涤3次,每次10min;再加入酶标二抗,37℃30min,TBST洗3遍,最后加入DAB显色。1.2.4PCR用临床分离培养的淋病奈瑟菌基因组DNA作为模板,按常规PCR条件进行扩增。上游引物5′2AGAGGCAGATATTTTCAGACTATCAG23′,下游引物5′2CAGATATCGGTGCGTAGTTTTCATACTG23′。反应条件:94℃预变性5min,加入TaqDNA聚合酶,然后按如下参数循环:94℃1min,55℃1min,72℃1min,最后1个...
