第27卷第5期2008年lO月华中农业大学学报JournalofHuazhongAgriculturalUniversityV01．27No．5Oct．2008，585～589香蕉穿孔线虫28SrRNA基因的D2／D3区序列分析★。．李佳1’2’彭德良”一黄文坤D("中国农业科学院植物保护研究所／植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193；，，2’中国农业科学院研究生院，北京100081)摘要采用线虫通用引物D2A和D3B对9个香蕉穿孑L线虫种群的核糖体DNA28S大亚基的D2／D3区进行了扩增，获得的片段长度约为780bp．克隆铡序后使用UPGMA法进行聚类分析和构建系统发育树。结果表明9个线虫种群D2／D3区核苷酸序列相似性为99．13％，其中8个群体的序列与越南报道的香蕉穿孔线虫近源种(Radopholussp．7BVietNam)的D2／D3区核苷酸序列(DQ328712)相似性为97．46％，说明香蕉穿孔线虫D2／D3区具有较大的保守性。聚类分析结果表明，RSHNl2r、RSSH、RSHL、RSHK、RSLZ、RSSZ、RSHNl3、RSHNl2p等8个种群聚为一类，亲缘关系很近，RSHN3群体与以上8个群体亲缘关系较远，说明RSHNt2r、RSSH、RSHL、RSHK、RSLZ、RSSZ、RSHNl3、RSHNl2p这8个香蕉穿孔线虫种群可能来源于同一地理种群，而RSHN3种群可能来源于另一个地理种群。关键词香蕉穿孔线虫；28SrRNA基因；D2／D3扩展区域中图法分类号S432．4+5文献标识码A文章编号1000-2421(2008)05-0585-05香蕉穿孔线虫Radopholussimilis(Cobb)Thorne是一种极具毁灭性的外来入侵线虫，已有55个国家和国际组织对其实施官方控制，是我国对外植物检疫对象之一[1]。该线虫寄主植物有350多种，可危害多种农作物和一些观赏植物，使作物减产30％～60％，甚至绝收[2|。近年来，随着我国加入wT0，农产品国际贸易往来迅速发展、人员交流的日益频繁和旅游业的发展，从香蕉穿孔线虫疫区国家或地区引进香蕉、花烛、肖竹芋、红掌、芭蕉及鹤望兰等花卉苗木及种质材料的种类和数量迅速增加，该线虫传人中国的风险日益剧增[a-s3。面对这种重大危险性外来线虫入侵的严重形势，非常有必要对其进行深入研究，明确系统发育关系、相近种分类关系进而建立一种快速和准确的检测方法。由于rRNA基因在生物体内含量较大且在进化过程中较为保守，因而它是探讨生物高级分类群系统演化的难得工具之一，近年来在分子系统进化研究中得到了广泛的应用【9]。28SrDNA是生物体基因组中最保守的区段之一，而28SrDNA-D2／D3区常被用来进行不同物种之间的同源性比较和系统进化研究En]，在各种生物中已有大量应用，在植物寄生线虫中的应用也很多1-10-11]。笔者对香蕉穿孔线虫28SrDNA—D2／D3区序列进行研究，旨在明确D2／D3区的核苷酸序列特征，为其系统发育、相近种分类和快速分子诊断提供理论依据。1材料与方法1．1供试线虫共收集9个香蕉穿孔线虫种群(表1)。其中RSsH、RSHL香蕉穿孔线虫种群为中国检疫科学院葛建军先生惠赠，RSSZ种群为深圳动植物检疫局李一农先生惠赠，RSLZ种群为华南农业大学廖金玲教授惠赠，其它种群为笔者所在实验室人员采集。1．2线虫DNA模板制备线虫DNA提取参照彭德良[12]的方法进行，并略加改动。挑取10头线虫放入装有7肛LddH20的Eppendorf管中，在一20℃的冰箱中冷冻过夜，取出后用75％酒精消毒的玻璃棒研磨至冰融化，加入10弘L的WLB(wormlysisbuffer)，3肛L蛋白酶收稿日期：2008-03—27；修回日期：2008-04—29*国家自然科学基金(30671363)、国家”十一五”科技支撑计划(2006BAI)08A14，2006BAD08A08)和公益性行业(农业)科研专项(ny-hyzx07—050)资助**通讯作者．E-rrmil：dlpeng@caas．net．cn；dlpeng@ippcaas．an李佳，女，1980年生，中国农业科学院植物保护研究所硕士研究生，北京100193．E-mail：lijiascarlet@163．corll万方数据华中农业大学学报第27卷K溶液(600t卫g／mL)，混匀并于10000r／min离心30S，一20℃下冷冻30min以上，然后转入PCR仪，在65℃下温育60min，95℃反应10rain，取出后104000r／rain离心1rain，取上清液进行PCR扩增或于--20℃保存备用。表1香蕉穿孔线虫种群来源TablelOriginofpopulationsofRadopholussimilisRSSH上衙Shanghai生姜”EU555404RSHI。上海Shanghai红掌2’EU555411RSSZ深圳Shenzhen红掌EU555412RSLZ广州Gu...
