细胞芯片捕获恶性胸水中癌细胞的临床应用价值VIP免费

94南昌大学学报(医学版)2010年第5O卷第12期JournalofNanchangUniversiw(MedicalScience)2O10，Vo1．50No．12细胞芯片捕获恶性胸水中癌细胞的临床应用价值刘翼军，王春福(江西省胸科医院a．病理科；b．肿瘤科，南昌330006)摘要：目的探讨抗体细胞芯片自动捕扶恶性胸水中癌细胞的临床应用价值。方法应用抗体细胞芯片技术对良、恶性胸水(各4o例)进行免疫杂交。结果8O例胸水细胞芯片阳性免疫杂交点细胞形分布，细胞形态完整，结构清晰，杂交点以外无非特异性结合细胞。其中4O例恶性胸水阳性杂交点为：j：皮特异性抗原37例、广谱CK39例、CD44V636例、CD6828例；另40例良：朐水细胞杂交点：CD44V65例见少量淋巴细胞。另6种CD系列抗体免疫杂交点仅捕获癌性胸水和良性胸水中的淋巴细胞、多核巨细胞，未见捕获癌细胞。结论细胞芯片捕获技术对胸水中恶性肿瘤细胞的诊断与鉴别诊断具有重要的临床应用价值。关键词：细胞芯片；捕获；免疫杂交；癌细胞；胸水中图分类号：R392．1文献标志码：A文章编号：1000—2294(2010)12—0094—03细胞芯片是在CDNA微阵列基础』二发明的一种特殊牛物芯片，具有体积小、信息量大、高通量、自动识别及町比性强的优点；能高效、快速和低消耗的进行细胞及组织学的各种研究与观察。。肿瘤标志物是对肿瘤进行诊断、分级、预后、检测治疗反应所必需的，对肿瘤细胞的诊断尤为重要。本研究采用细胞卷片技术制作8O例胸水细胞芯片，同时采用抗体与细胞抗原特异性结合的方法，通过自动捕获将所获得的细胞旧定在特定区域，对胸水中肿瘤细胞进行诊断和鉴别诊断。l材料与方法1．1标本来源收集2006年]月至2010年6月江西省胸科医院门诊及住院患者8O例，均经支气管镜病理组织活检、细胞学涂片证实。其中男55例，女25例，年龄26～78岁。良、恶性胸水各4O例。】．2主要试剂上皮特异性抗原(ESA)、广谱CK、CI)44V6、T细胞(CI)3、CD45RO)、B细胞(CD20、CD79oc)、霍奇金细胞(CDI5、CD30)、巨噬细胞(CD68)，均为单克隆抗体，由福州迈新生物技术有限公司提供。1．3细胞芯片的制作1．3．1细胞j巷片的设H‘抗体微阵列(每一抗体4个位点)。①细胞芯片模块制备：将溶化石蜡倒入大号不锈钢底模中，制作收稿日期：2010一l0⋯27基金项目：汀省卫q三厅科技计划(05】173)3．5em×2．5cm×0．8cm大小的空白蜡块，待石蜡稍微冷却，设计8×5细胞芯片微阵列，用打孔机将受体蜡块进行打孑L，每孔直径约2mm。将蜡块冷冻后，进行切片，每片10n-i，裱于玻片上。制成微阵列玻片。②点样：每种抗体与pH10．2的Tris—HC1缓冲液等体积稀释。抗体芯片按上述10种抗体，每4孑L1种抗体依次排列进行点样，将10种抗体分别点在各自的区域内，形成8×5微阵列。点样后将芷：片玻片置于湿盒中，4℃冰箱水化、过夜。1．3．2封闭用2．5酪蛋白PBS溶液室温下封闭芯片1h，封闭抗体外的非特异性结合区，PBS冲洗2次。1．3．3杂交取EDTA—K冲洗标本细胞3次，每次3min，使细胞膜抗原充分暴露，调整细胞浓度为lO。I、制成细胞悬液，将细胞悬液直接滴在芯片上孵育1h，使细胞与特异性抗体充分结合，PBS冲洗3次，每次3min。109／6甲醛固定细胞30min。1．3．4染色芯片巴氏染色。主要染色步骤：①将苏木精染液滴在芯片上，孵育l()～20min，PSB冲洗3次，每次3min；②用0．5的盐酸去掉胞浆中多余的苏木精染液，数秒钟后PBS冲洗3次，每次3min；③置稀碳酸锂溶液中碱化1min，PBS冲洗3次，每次3min；④用95乙醇脱水2rain；⑤用橘黄G染液1～3min；⑥95乙醇洗涤2次，各1O～2Os；⑦在刘翼军等：细胞芯片捕获恶性胸水中癌细胞的临床应用价值95EA36染液中染色2～3min，至胞浆着色为止；⑧用95乙醇洗涤2～3次，去除过多的染液，再置无水酒精中脱水，然后置二甲苯中洗涤2次。用中性树胶封固。2结果2．1杂交图像应用光学显微镜40、100、200、400等倍数进行逐级观察，阳性杂交点细胞呈圆形分布，界限清楚。细胞形态保存良好，杂交点以外未见待异性结合细胞，见图12。’图1胸水免疫杂交阳性细胞(光学显微镜，×400)图2胸水免疫杂趸I性细胞(光学显微锐，×200)2．2杂交结果40例肺癌胸水经过细胞芯片杂交，阳性杂交点分别为：CD44V636例、ESA37例、广谱CK39...