山东大学实验报告2018年5月28日一、实验目的1.学习细胞凋亡的简史、概念和原理。2.了解细胞凋亡的检测方法。3.掌握诱导和形态学观察动植物细胞凋亡的基本方法。二、实验原理1.细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，也称细胞程序性死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。2.细胞凋亡的生理意义1）维持生物体内环境的稳定；2）参与防御反应；3）胚胎发育过程中清除一些细胞。3.细胞凋亡的检测方法•细胞凋亡的形态学检测•磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）•线粒体膜势能的（△甲mt）检测•DNA片段化检测•TUNEL法•Caspase-3活性的检测•WB检测•凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析4.细胞凋亡的形态学检测未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜破裂、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。5.细胞凋亡的诱导因素＞物理因素：射线、热休克、冷激等。＞化学因素：重金属离子、激素、毒素、活性氧、一氧化氮等。＞生物因素：病毒、细菌、肿瘤坏死因子、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成抑制剂等。姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午科目：细胞生物学实验题目：细胞凋亡的诱导及观察学号：2016001400556．细胞坏死细胞坏死（necrosis）被认为是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，后期细胞核膨大，最后细胞破裂。细胞裂解释放出内含物，并常引起炎症反应。7.吖啶橙（AO）吖啶橙是一种荧光色素，它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。三、实验用品1.实验材料：HeLa细胞，源自一位美国黑人妇女海瑞塔•拉克斯（HenriettaLacks）的宫颈癌细胞系。2.实验试剂：含10%小牛血清的DMEM高糖培养基，甲醇固定液，PBS,VP-16,吖啶橙染液，瑞氏染液。3.实验仪器：超净工作台，CO培养箱，小型高速离心机，高压灭菌锅，荧光显微镜，普通光学显微2镜，倒置光学显微镜。4.实验用具：无菌离心管，无菌滴管，酒精灯，镊子，移液器，吸头，试剂瓶，载玻片，盖玻片，35mm细菌培养皿。四、实验步骤1.细胞培养和凋亡药物诱导处理（由老师完成）1）在细胞培养室中复苏和传代培养HeLa细胞，使细胞处于对数生长期。2）实验前2d将盖玻片放置入35mm细菌培养皿，并将细胞种植在培养皿上，分为实验组和对照组。3）实验前1d使得细胞的底部汇合度约为60%-70%,加入VP-16至终浓度为0.1mmol/L，在37°C培养箱中继续孵育24h。对照组加入等量的DMSO。2.倒置显微镜下观察在培养完成后，从培养箱中将35mm培养皿取出，在倒置显微镜下进行观察，拍照记录结果。3.吖啶橙染色后荧光显微镜观察1）固定：将实验组和对照组培养皿中的培养液吸去，用PBS清洗1-2遍，加入适量的预冷甲醇,冰箱中零上低温固定10min，之后取出培养皿，吸去甲醇，用PBS清洗2-3遍。2）染色：在培养皿中加入少量吖啶橙（稍没过盖玻片即可），染色5min，之后吸去染液，用PBS清洗2-3遍。3）制片：取一张洁净干燥的载玻片，中央滴一滴PBS，用镊子小心地从培养皿中取出盖玻片，将朝上的一面（长有细胞的一面）向下，盖在载玻片滴有PBS的区域，注意不要有气泡，之后用吸水纸从盖玻片边缘吸出多余PBS。4）观察：在荧光显微镜...
