主要需要考察的方面：加热方式升降温速度准确性均一性激发光源检测元件检测通路监测系统详情请参考全文……回顾分子生物学的发展历程，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-timequantitativePCR,orqPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。本文从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术，为定量PCR仪的选择提供详细参考。一、背景本来，PCR是为了将样本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性，随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线——因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。通过传统凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数(CT值)，计算起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。相对定量常见于比较两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。荧光实时定量PCR技术最早是在1992年由一位日本人Higuchi第一次报告提出的，他当时的初衷很简单，就是想实时地看到PCR反应的整个过程，由于当时EB（溴化乙锭）的广泛使用，最直接想到的标记染料就是EB，可以插入到双链核酸中受激发光。这样，在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台可实时监测的PCR仪就诞生了。在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，考虑到PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以定量待测样品中的目标基因。定量PCR技术的提出不单是PCR技术的飞跃，也DNA定量技术的一次飞跃。经过不断发展完善，到1996年当时的PE公司（后来的ABI）推出了世界第一台商品化的荧光定量PCR仪，标记方法也由最初的染料法，逐渐发展到了特异性更高的Taqman探针法，以及MolecularBeacon、Fret等不同方法的标记探针。由于ABI公司在PCR领域的领袖地位和推动定量PCR技术的早期发展的特殊贡献，Taqman探针法得到广泛使用。二、常用荧光标记方法常用的荧光标记方法可简单分为两大类：1.非特异检测——双链dna内插式荧光染料；2.扩增序列专一检测——主要指荧光探针和引物探针。荧光染料技术成本低廉，实验设计简便；而探针杂交技术在原理上严格，所得数据特异性高、更为精确。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。非特异性检测扩增序列的代表是SYBRGreenI荧光染料。SYBRGreenI只与DNA双链结合，插入DNA双链时发出荧光；DNA双链解链时释放出来，荧光信号急剧减弱。在一个加入过量SYBRgreen1荧光染料的体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBRGreen荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸完成后，SYBRGreen染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大...
