2中国海洋大学实验报告实验一培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。4.每2人一组，每人一份实验报告。二、实验材料1、药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、1NHCl、1NNaOH。2、设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。3、材料：天平、药匙、电炉、pH试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签等。移液器（1mL0.2mL）。三、实验内容(一)培养基的配制1、培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。3)调pH值：用1NNaOH或1NHCl调pH，用pH试纸对照。4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。7)灭菌：在高压锅中，115C高温灭菌30min。2、培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH8.0。3取50mL分装250mL三角瓶后，8层纱布封口，外包1层牛皮纸，121C高温灭菌20min。B.2216E斜面（固体）：海水2216E液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内加入3mL，121C高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。2支/小组，共65组，130支。（15×150规格，带试管帽）300mL。C.无菌生理盐水和保种液：生理盐水：NaCl0.85%蒸馏水配制。每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121C高温灭菌20min。保种液：生理盐水，加25%甘油。D.碳源优化培养基：以海水2216E液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。优化实验中每小组做1种碳源，即5个小组完成一个碳源优化实验。每种碳源配12瓶（50mL/个三角瓶，共600mL。8层纱布封口，外包1层牛皮纸，灭菌。）(二)分离培养微生物常用器皿的准备1、清洗一些玻璃仪仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿等。2、制作8层纱布（108个），酒精棉（2瓶）。3、Tip头（0.2，1ml，分装枪头盒，牛皮纸包好，灭菌）；保种管（6支/包，共12包）药勺（1把/包，共12包，包好，灭菌）长竹签（6支/包，共12包，包好，灭菌）4、卫生（308实验室超净台，实验台面）(三)培养基和玻璃器皿的灭菌方法1、加压蒸汽灭菌法。其步骤如下：1)灭菌锅内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。2)接通电源，进行加热。43)排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出冷空气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到将近零时，再关闭排气阀。4)当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时,此时灭菌锅内的温度为121℃,维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。5)灭菌时间一到，切断电源。待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌锅盖，取出物品。2、紫外线灭菌一般使用30W灯管，9m3空间，距地面2m，打开紫外灯照射0.5h，可使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此上适用于空气表面杀菌。3、化学药剂消毒灭菌微生物实验室中常用的化学杀菌剂有酒精、甲醛、高锰酸钾、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、来苏尔、过氧乙酸等，它们有的是杀菌剂，有的是抑制剂。四、思考题1、固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？答：固体培养基加琼脂后加热溶化时应该注意一下问题：1)在加热融化时要注意温度。因为琼脂是由从石花菜中提取的胶体多糖制成，它在98℃水中能溶解，温度降至45℃时就凝成固体。所以温度太低时会使琼脂凝成固体，太高又会使其糊化；2)受热要均匀，可以垫上石棉网，在加热过程中，要用玻璃棒不停缓慢搅拌,防止糊底或者是溢出，加热溶化后要注意补充所失水分；3)加热完毕后，需在合适的温度（60℃左右...
