植物生物工程实验植物DNA提取、质量检测及特定基因片段操作综合实验二郝大海实验目的了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法了解PCR原理，熟悉操作步骤掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法保证DNA一级结构的完整性排除其它分子的污染RNA、蛋白质、多糖等DNA提取的原则实验原理（DNA提取）DNA存在部位主要存在于细胞核中，线粒体和叶绿体中也少量存在基因组DNA的提取CTAB法SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法DNA提取的方法在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA.②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA.③用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀CTAB法原理CTABCTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物高盐溶液中（高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl>0.7mol/LNaCl），该复合物可溶的），该复合物可溶的有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质上清加入乙醇沉淀上清加入乙醇沉淀DNADNA。。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTABCTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入SDS法原理SDS阴离子去垢剂高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNASDS组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方DNA提取基本步骤材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存基因组基因组DNADNA新鲜材料，低温保存新鲜材料，低温保存细胞培养时间不能过长细胞培养时间不能过长材料准备材料准备基因组基因组DNADNA材料过多影响裂解，导致材料过多影响裂解，导致DNADNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨植物材料－－液氮研磨培养细胞－－蛋白酶培养细胞－－蛋白酶KK细胞裂解细胞裂解采用吸附材料吸附分离采用吸附材料吸附分离DNADNA，应提供相应的缓冲体系，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚采用有机溶剂（酚//氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法的方法核酸分离纯化核酸分离纯化多糖的去除：多糖水解酶蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理多酚的去除：加入还原剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤预冷...
