实验九酪氨酸酶的动力学1.学会测定酶反应速度的基本方法。2.掌握测定米氏常数Km值的原理和方法。【目的和要求】【实验原理】酪氨酸酶催化的反应为：475nm常用单位时间内、产物的浓度增加量表示。一、酶活力测定—酶反应初速度的测定:TimeProductConcentrationv=dC/dtA=εCd:3600M-1cm-1d:1cm确定酶反应时间！二、底物浓度[S]对酶反应速度：[S][S]VmaxmKv一级反应混合级反应零级反应Effectofsubstrateconcentrationontheinitialvelocityofanenzyme-catalyzedreaction.½VmaxKmKm值测定:双倒数作图法（一）酶反应初速度的测定：---酶反应时间的确定在比色杯中，按下表依次加入试剂：【实验方法】加入酶液后立即混匀，并每隔15秒读取475nm处的吸光值。L-多巴（mL）1磷酸缓冲液（mL）1.97酪氨酸酶（mL）0.03注：酪氨酸酶5U/l绘制产物浓度C-Time反应曲线，观察酶反应初速度，确定酶反应时间。一般在30~120秒左右。时刻（秒）A时刻（秒）A0135151503016545180601957521090225105240120255各时刻的吸光值记录在下表：（二）米式常数的测定：在比色杯中，采用已确定的酶反应时间X，分别记录各管反应开始时A0和X秒钟后的A1。管号15mML－多巴(ml)磷酸缓冲液（ml）酪氨酸酶（ml）10.22.770.0320.32.670.0330.42.570.0340.52.470.0350.62.370.03每管反应体系仍为3ml。记录数据于下表：利用双倒数作图法，横坐标为1/S，纵坐标为1/v，分别求出Vmax和Km。管号L－多巴浓度（mM）A0A1ΔA（A1-A0）V（mM/min）12345【思考题】1.为什么酶活力测定的是酶反应初速度？如何确定酶反应时间？2.Km值的意义是什么？
