PCR假阳性等问题VIP免费

PCR 检测常见问题与解决途径 利用PCR 方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR 检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的 PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。 本文对 PCR 检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。 一、假阳性： （一）假阳性现象 假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。 （二）造成假阳性的原因 1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染； 2. PCR 试剂的污染：主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。 3. PCR 扩增产物污染：这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为 PCR 产物拷贝量大(一般为 1013 拷贝/m l)，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产物污染，就可形成假阳性。 4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。 5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。 （三）假阳性问题的试验控制 在每次 PCR 检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明 DNA 提取（RNA 提取、RNA 反转录）、DNA 扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性...