RNA探针杂交步骤以及效价测定VIP免费

R N A 探针杂交步骤以及效价测定 RNA 探针是一段单链cDNA 分子，本文总结了RNA 探针的分类、制备方法、探针的纯化、杂交前的注意事项，RAN 探针效价的测定以及探针的选择。 RNA 原位杂交中的探针 (一)探针的种类 RNA 探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA 或cRNA 分子。根据在 RNA 杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性 cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。 1. 单链cDNA 探针： 由于 cDNA 中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA 探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA 探针的制备比较困难，在 RNA 原位杂交中已很少见有应用。 2. cRNA 探针： 是以cDNA 为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA 探针做杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA 与 RNA 之间形成的杂交体要比 cDNA-RNA 杂交体稳定。cRNA-RNA 之间形成的杂交体不受 RNA 酶的影响。因此杂交反应后可用 RNA 酶处理，以除去未结合的探针。由于 cRNA 探针具有以上这些优点，cRNA 探针的杂交饱和水平又比双链DNA 探针高出8 倍，因此在原位杂交中应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对 RNA 酶敏，易受破坏，操作中要谨防 RNA 酶污染。 3. 寡核苷酸探针： 人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过 DNA 合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与 m RNA 形成的杂交体不如 cRNA-RNA 杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。 依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括3H、35C、32P 和 125I 等，不同的同位素探针其穿透力、定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短、性能不稳定、污染环境和危害健康等原因，在 RNA 原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶...