荧光定量PCR的CT值VIP免费

检验荧光定量PCR的CT值来源：原博士带你做检测PART01Ct值的基本概念PART02与Ct值有关的参数PART03Ct值与模板拷贝数的关系PART04关于qPCR中Ct值的几点思考CONTENTS目录PARTONECT值的基本概念PARTONECT值的基本概念阈值循环数Thresholdcycle(Ct)也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同，进而影响阈值和Ct值。PARTONECT值的基本概念Ct值不是恒定不变的，可以受到不同样品、不同仪器的影响，即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍，Ct值也会存在差异。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。PART与Ct值有关的参数TWO标准曲线Standardcurve：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。相关系数Correlationcoefficient(R^2)：反映了标准曲线的线性，通常要求>0.99。发展成果斜率Slope：当扩增效率为100%时斜率为-3.32，当90%-110%时的斜率为-3.58~-3.10。扩增效率Efficiency(E)：通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。PARTCt值与模板拷贝数的关系PARTTHREECt值与模板拷贝数的关系理想情况下：扩增产物量Cn=起始模板量C1×（1+扩增效率E）^循环数n实际情况下：由于E通常无法达到100%，并且在扩增的后期，扩增效率会逐渐降低。因此，只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始浓度差2倍。PARTTHREECt值与模板拷贝数的关系目前最常用的qPCR定量的方法，即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增，将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。分析定量时，一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。用qPCR进行定量，理论上可行，实际上很难获得准确的定量结果。PART关于qPCR中Ct值的几点思考网络推广联盟思考PARTFOUR关于qPCR中Ct值的几点思考1、Ct值能否直接换算成模板拷贝数？2、荧光定量PCR是否为定量方法？3、Ct值能否作为评价qPCR试剂盒的指标？4、能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性？PARTFOUR工作概述1、Ct值能否直接换算成模板拷贝数？通过制作标准曲线（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10）的方法可以获得未知样品的初始模板拷贝数，前提是需要样品与标准品同时扩增，定量标准品需要使用标准物质等定量准确的物质（OD260/280换算的的拷贝数误差很大），即使如此定值结果仍存在一定的误差。PARTFOUR工作概述2、荧光定量PCR是否为定量方法？虽然名字里有“定量”，但是qPCR的间接定量方式又复杂，又受很多因素影响，又不准确，在计量领域是不被认可的。目前的核酸检测方法中只有数字PCR是真正的定量检测方法，其余的都是定性检测方法。PARTFOUR工作概述3、Ct值能否作为评价qPCR试剂盒的指标？qPCR试剂的评价需要从分析敏感性（最低检测限），分析特异性（交叉反应），重复性（精密度），诊断敏感性，诊断特异性等多个指标去衡量。仅凭Ct值的高低去判断一个qPCR试剂盒的优劣太片面，不同试剂盒的Ct值不具有可比性。有些试剂盒采取先进行几个循环的预扩增，再进行正式循环的做法就是为了使Ct值看起来更低。PARTFOUR工作概述4、能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性？（1）从原理上解释理论上，假设初始模板量为1个拷贝，酶的扩增效率100%，到达最大阈值约需要35个循环，因此业内...