检验荧光定量PCR的CT值来源:原博士带你做检测PART01Ct值的基本概念PART02与Ct值有关的参数PART03Ct值与模板拷贝数的关系PART04关于qPCR中Ct值的几点思考CONTENTS目录PARTONECT值的基本概念PARTONECT值的基本概念阈值循环数Thresholdcycle(Ct)也写作Cq值,荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线(baseline),是由于测量的偶然误差引起的。阈值(threshold)一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号,用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响,每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不同,进而影响阈值和Ct值。PARTONECT值的基本概念Ct值不是恒定不变的,可以受到不同样品、不同仪器的影响,即使相同的样品在相同的仪器上重复2遍,Ct值也会存在差异。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高,Ct值越小;起始模板量浓度越低,Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,Ct值的重现性较好,即相同含量的初始模板,得到的Ct值是相对稳定的。PART与Ct值有关的参数TWO标准曲线Standardcurve:模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。相关系数Correlationcoefficient(R^2):反映了标准曲线的线性,通常要求>0.99。发展成果斜率Slope:当扩增效率为100%时斜率为-3.32,当90%-110%时的斜率为-3.58~-3.10。扩增效率Efficiency(E):通常要求在90%~110%。效率低于100%,是由于PCR反应中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。PARTCt值与模板拷贝数的关系PARTTHREECt值与模板拷贝数的关系理想情况下:扩增产物量Cn=起始模板量C1×(1+扩增效率E)^循环数n实际情况下:由于E通常无法达到100%,并且在扩增的后期,扩增效率会逐渐降低。因此,只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n,即Ct值差1,初始浓度差2倍。PARTTHREECt值与模板拷贝数的关系目前最常用的qPCR定量的方法,即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增,将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。分析定量时,一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足:E:90%~110%,R^2≥0.99,斜率-3.58~-3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。用qPCR进行定量,理论上可行,实际上很难获得准确的定量结果。PART关于qPCR中Ct值的几点思考网络推广联盟思考PARTFOUR关于qPCR中Ct值的几点思考1、Ct值能否直接换算成模板拷贝数?2、荧光定量PCR是否为定量方法?3、Ct值能否作为评价qPCR试剂盒的指标?4、能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性?PARTFOUR工作概述1、Ct值能否直接换算成模板拷贝数?通过制作标准曲线(E:90%~110%,R^2≥0.99,斜率-3.58~-3.10)的方法可以获得未知样品的初始模板拷贝数,前提是需要样品与标准品同时扩增,定量标准品需要使用标准物质等定量准确的物质(OD260/280换算的的拷贝数误差很大),即使如此定值结果仍存在一定的误差。PARTFOUR工作概述2、荧光定量PCR是否为定量方法?虽然名字里有“定量”,但是qPCR的间接定量方式又复杂,又受很多因素影响,又不准确,在计量领域是不被认可的。目前的核酸检测方法中只有数字PCR是真正的定量检测方法,其余的都是定性检测方法。PARTFOUR工作概述3、Ct值能否作为评价qPCR试剂盒的指标?qPCR试剂的评价需要从分析敏感性(最低检测限),分析特异性(交叉反应),重复性(精密度),诊断敏感性,诊断特异性等多个指标去衡量。仅凭Ct值的高低去判断一个qPCR试剂盒的优劣太片面,不同试剂盒的Ct值不具有可比性。有些试剂盒采取先进行几个循环的预扩增,再进行正式循环的做法就是为了使Ct值看起来更低。PARTFOUR工作概述4、能否通过增加扩增循环数来增加试剂盒的敏感性?(1)从原理上解释理论上,假设初始模板量为1个拷贝,酶的扩增效率100%,到达最大阈值约需要35个循环,因此业内...