普通PCR常见问题及解决对策

普通PCR 常见问题及解决对策 一、普通PCR 常见问题及解决对策 PCR 产物的电泳检测时间一般为48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 1. 假阴性，不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有 ①模板核酸的制备， ②引物的质量与特异性， ③酶的质量及活性 ④PCR 循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 1.1 模板 ①模板中含有杂蛋白质， ②模板中含有Taq 酶抑制剂， ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白， ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 1.2 酶失活 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 1.3 引物 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 1.4 Mg2+浓度 Mg2+离子浓度对PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 1.5 反应体积的改变 通常进行 PCR 扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul ，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 1.6 物理原因 变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标...