百度文库1 实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定一、实验目的： 通过本实验的学习，掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定技术，掌握高速冷冻离心机、可见分光光度计、核酸蛋白检测仪、电泳仪等仪器的使用。二、基本原理：鸡卵类粘蛋白 (chicken ovomucoid 简称 CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋白至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈不均一性。目前至少已获得四种不同的组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖部分（主要为D-甘露糖、 D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上则有差别。它们的等电点有一定的范围，大致在pH3.9~4.5 。相对分子量 28，000。卵类粘蛋白抑制胰蛋白酶克分子比为1：1，因此高纯度的卵类粘蛋白1 微克能抑制相当于0.86 微克的胰蛋白酶（比活力为12，000BAEE单位/ 毫克蛋白）。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差异，鸡卵类粘蛋白 N—末端基为丙氨酸（ C—末端为苯丙氨酸）。卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定， 尤其当温度较高时易迅速失活。 鸡卵类粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。本实验主要参照 Kassell所述的方法，先将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）—丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，在经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品。三、试剂与器材3.1 粗提所需试剂：丙酮， 0.5M 三氯乙酸， 0.2M pH6.5 磷酸盐缓冲液；3.2 纯化所需试剂：0.02M pH6.5 磷酸缓冲液，；DEAE-纤维素 32 或 52，0.5M 氯化钠 -0.5M 氢氧化钠溶液， 0.5M 盐酸， 0.02M，pH6.5 磷酸盐缓冲液 ,0.30M 氯化钠 -0.02M pH6.5 磷酸盐缓冲液， 1.0 M 氯化钠 -0.02M pH6.5 磷酸盐缓冲液，聚乙二醇8000，蔗糖。3.3 胰蛋白酶活力及粘蛋白抑制活力测定试剂：0.05M pH8.0Tris-HCl缓冲液， BAEE-0.05M,pH8.0 Tris-HCl缓冲液（每毫升Tris-HCl缓冲液含0.34 毫克 BAEE和 2.22 毫克氯化钙），结晶胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL, 0.1M pH8.0 磷酸盐缓冲液配制），0...
