ELISA 原理 －－操作规则（新手适用） 酶联免疫吸附实验 ELISA 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP 酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP 的A（1cm 403nm 1%）＝ 25，式中 1％ 指 HRP 百 分浓度为100ml 含酶蛋白1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP 的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP 纯度（RZ）=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒ einheit Zahl）值 越 大说 明 酶内 所含杂 质 越 少 。高 纯度HRP 的RZ 值 在3.0 左 右 ，最高 可 达 3.4。用于ELISA 检 测的HRP 的RZ 值 要 求 在3.0 以上。 ELISA 的 基 本 原 理 有 三 条 ： （ 1） 抗 原 或 抗 体 能 以 物 理 性 地 吸 附 于 固 相 载 体 表 面 ， 可 能 是 蛋 白 和 聚 苯 乙 烯表 面 间 的 疏 水 性 部 分 相 互 吸 附 ， 并 保 持 其 免 疫 学 活 性 ； （ 2） 抗 原 或 抗 体 可 通 过 共 价 键 与 酶 连 接 形 成 酶 结 合 物 ， 而 此 种 酶 结 合 物 仍 能保 持 其 免 疫 学 和 酶 学 活 性 ； （ 3） 酶 结 合 物 与 相 应 抗 原 或 抗 体 结 合 后 ， 可 根 据 加 入 底 物 的 颜 色...
