QPS—201 加样流程和 Step One Plus 仪器的仪器操作要准备的东西:1.八排管和盖子2.96 孔细胞培育板3.移液器:10ul,20ul,100ul,200ul。4.枪头 10ul,20ul,100ul,200ul 或者 300ul.5.200ul 和 600ul 的 PCR 管.6.试剂:QPk—201,上下游引物,cDNA,去 RNA 酶的 PCR 水7.注意事项:A。引物的储存浓度 100nm,工作浓度:5—10nmol,引物要过量,上下游引物要先混匀在一起,然后再加.内参 actin 和目标基因的引物都要混匀.混匀后的引物可用半个月,用时要反复混匀,水样的东西混 20 下,油状的(酶)东西至少要混 30 下.B.试剂配总管用,cDNA 和酶 mix 配一管,引物和水配一管。混匀之后,再分别加到管子里。为什么试剂要配总管呢?cDNA 模板量很少,所以加多加少对实验影响很大,酶加 10ul,样多,少量的东西要想混匀,必须放在大量的东西里这样再去混匀,就可以使每个管子里的样品都能保证是一致的。C。内参和目标基因都要跑 3 个复孔,取平均值,差异 CT 值要在 0。5 之内,假如 Ct 值>0.5,结果就不可信,要重新再做.(一)QPk-201 加样流程:用 QPk—201 做样品体系是 20ul 的.cDNA :2ulPCR 水:6ul上下游引物共:2ul酶 MIX:10ul一共是 20ul 体系。把 cDNA :2ul 和酶 mix:10ul 共 12ul 配一管.把引物:2ul 和水 6ul 共 8ul 配一管。以下以样品为例,加样流程如下:目标基因 STOB1,样品六个,编号:1,2,3,C5,C6,C7内参基因 actin样品123C5C6C7目 标 基 因STOB1STOB1STOB1内参ActionActionAction如何计算是关键:6 个样品,每个样品配一管,再分 6 次加,但是要考虑都损失,所以要多加 10%的量,以避开最后没得加了。cDNA 和酶配一管:cDNA:2×6×1。1=13.2ul酶 Mix:10×6×1。1=66ul,在总管里吹打 30 次混匀,取 12ul。引物和水配一管:引物:2×18×1.1=39。6ulPCR 水:6×18×1。1=118。8ul,在总管里吹打 20 次混匀,取 8ul。配完之后要混匀.剩下的就是加样,贴在一侧的壁上,加样时,先吹打,再吸,贴壁打到底,按着不松,把移液器收回来。加一个样品,就换一个枪头。加另一管的时候,把管子反过来,再在这一侧壁上加管,的就不用换枪头了。这个加样的步骤一般是在碎冰上操作的,试剂一定要放在冰上的。加完之后,轻轻的盖上盖子,放在离心机里离心,让试剂都落到管子底部去。离心完之后,就可以放到定量 PCR 仪的黑色的 96 孔板子上了,然后打开机器,放进去,开始设置了。