定量PCR加样操作流程

QPS—201 加样流程和 Step One Plus 仪器的仪器操作要准备的东西:1.八排管和盖子2.96 孔细胞培育板3.移液器：10ul，20ul，100ul，200ul。4.枪头 10ul，20ul，100ul，200ul 或者 300ul.5.200ul 和 600ul 的 PCR 管.6.试剂：QPk—201，上下游引物，cDNA，去 RNA 酶的 PCR 水7.注意事项：A。引物的储存浓度 100nm，工作浓度:5—10nmol,引物要过量,上下游引物要先混匀在一起，然后再加.内参 actin 和目标基因的引物都要混匀.混匀后的引物可用半个月，用时要反复混匀，水样的东西混 20 下,油状的(酶）东西至少要混 30 下.B.试剂配总管用，cDNA 和酶 mix 配一管，引物和水配一管。混匀之后，再分别加到管子里。为什么试剂要配总管呢?cDNA 模板量很少，所以加多加少对实验影响很大,酶加 10ul，样多，少量的东西要想混匀,必须放在大量的东西里这样再去混匀，就可以使每个管子里的样品都能保证是一致的。C。内参和目标基因都要跑 3 个复孔，取平均值，差异 CT 值要在 0。5 之内,假如 Ct 值>0.5，结果就不可信,要重新再做.（一）QPk-201 加样流程:用 QPk—201 做样品体系是 20ul 的.cDNA ：2ulPCR 水：6ul上下游引物共:2ul酶 MIX：10ul一共是 20ul 体系。把 cDNA ：2ul 和酶 mix：10ul 共 12ul 配一管.把引物：2ul 和水 6ul 共 8ul 配一管。以下以样品为例，加样流程如下：目标基因 STOB1，样品六个，编号：1,2,3，C5，C6,C7内参基因 actin样品123C5C6C7目 标 基 因STOB1STOB1STOB1内参ActionActionAction如何计算是关键：6 个样品，每个样品配一管，再分 6 次加，但是要考虑都损失，所以要多加 10%的量，以避开最后没得加了。cDNA 和酶配一管：cDNA:2×6×1。1=13.2ul酶 Mix:10×6×1。1=66ul，在总管里吹打 30 次混匀,取 12ul。引物和水配一管：引物：2×18×1.1=39。6ulPCR 水：6×18×1。1=118。8ul,在总管里吹打 20 次混匀，取 8ul。配完之后要混匀.剩下的就是加样，贴在一侧的壁上，加样时，先吹打，再吸，贴壁打到底，按着不松，把移液器收回来。加一个样品,就换一个枪头。加另一管的时候,把管子反过来,再在这一侧壁上加管,的就不用换枪头了。这个加样的步骤一般是在碎冰上操作的，试剂一定要放在冰上的。加完之后，轻轻的盖上盖子,放在离心机里离心，让试剂都落到管子底部去。离心完之后,就可以放到定量 PCR 仪的黑色的 96 孔板子上了,然后打开机器，放进去，开始设置了。