电化学发光测定原理

电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定电化学发光反应：电化学发光(electro-chemiluminescence,ECL)是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+(图 1)和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应(图 2)。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂。TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+*(参见图 2),后者很不稳定，自发地失去一个质子(H+)，形成自由基 TPA*，这是一种非常强的还原剂。这两个高反应基团在电极表面迅速反应，三价的[Ru(bpy)3]3+被还原形成激发态的二价[Ru(bpy)3]2+*，能量来源于[Ru(bpy)3]3+和 TPA*之间存在的高电化学电位差。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的[H][Ru(bpy)3]2+*衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长 620nm 的光子。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。图 1 三联吡啶钌 NHS1z--H+TPA*TPA图 2 在电极表面的 ECL 反应Ru2＋:[Ru(bpy)3]2+基态R3u＋:[Ru(bpy)3]3+氧化态Ru2＋*:[Ru(bpy)3]2+*激发态二、电化学发光免疫测定以三联吡啶钉作为标记物，标记抗原或抗体，通过免疫反应及 ECL 反应，即可进行电化学发光免疫测定(ECLIA)。在实际应用中则尚有特定的仪器和试剂。瑞士罗氏公司(ROCHE)的 ElecsysECLIA 系统，综合了各种先进技术，具有独特的优越性，已在医学检验中取得广泛应用。Elecsys 全自动分析仪分成两个部分：在试管内化学反应部分和在流动池内的 ECL 反应部分。(一)试管内的化学反应1、试剂的组成在 Elecsys 试剂的制备中，包括电化学发光剂的标记和抗原或抗体的固相化，应用了多种先进技术，简述如下：(1)电化学发光剂的标记[Ru(bpy)3]2+需经化学修饰形成活化的衍生物后才能与抗体或抗原形成结合物。有多种活性基团可与[Ru(bpy)3]2+分子中的砒啶基反应。在 Elecsys 试剂中采用的是 N 羟基琥珀酰胺酯(NHS)(图 1)。该衍生物具有水溶性，可与抗体、蛋白质抗原、半抗原、激素、核酸等各种分子结合形成稳定的标记物。而且[Ru(bpy)3]2+NHS 分子量很小，与免疫球蛋白结合的分子比超过20 仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性。(2)固相载体Elecsys 中采用的固相载体是带有磁性的直径约 2.8pm 的聚苯乙烯微粒。其特点是表面积极大，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度快。由于带有磁性，在...