蛋白质测定方法之双缩脲法

一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经 180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1~10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白用 0．05N NaOH 配制。（2）双缩脲试剂：称以 1.50 克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和 6.0 克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用 500 毫升水溶解，在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH 溶液，用水稀释到 1 升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2.器材：可见光分光光度计、大试管 15 支、旋涡混合器等。（三）操作方法1.标准曲线的测定：取 12 支试管分两组，分别加入 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到 1 毫升，然后加入 4 毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置 30 分钟，于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对比液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取 2~3 个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml。三、Folin—酚试剂法（Lowry 法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试...