表达载体得构建方法及步骤一、载体得选择及如何阅读质粒图谱 目前,载体主要有病毒与非病毒两大类,其中质粒 DNA 就是一种新得非病毒转基因载体。一个合格质粒得组成要素:(1)复制起始位点 Ori 即控制复制起始得位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。(2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+ ,Kan+(3)多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段(4) P/E 启动子/增强子(5)Terms 终止信号(6)加 poly(A)信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建得目得,同时要考虑载体中应有合适得限制酶切位点。假如构建得目得就是要表达一个特定得基因,则要选择合适得表达载体。载体选择主要考虑下述 3 点:【1】构建 DNA 重组体得目得,克隆扩增/基因表达,选择合适得克隆载体/表达载体。【2】、载体得类型:(1)克隆载体得克隆能力－据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。(2)表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭,E、coli/哺乳类细胞表达载体。(3)对原核表达载体应该注意:选择合适得启动子及相应得受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难与阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体得参考。【3】载体 MCS 中得酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目得基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。综上所述,选用质粒(最常用)做载体得 5 点要求:(1)选分子量小得质粒,即小载体(1－1、5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);(2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般 10 个以上得拷贝,而严谨型质粒<10 个。(3)必需具备一个以上得酶切位点,有选择得余地;(4)必需有易检测得标记,多就是抗生素得抗性基因,不特指多位 Ampr(试一试)。(5)满足自己得实验需求,就是否需要包装病毒,就是否需要加入荧光标记,就是否需要加入标签蛋白,就是否需要真核抗性(如 Puro、G418)等等。无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采纳适当得限制酶将载体 DNA 进行切割,获得线性载体分子,以便于与目得基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步:首先瞧 Ori 得位置,了解质粒得类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步:再瞧筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。(1)Ampr 水解 β－内酰胺环,解除氨苄得毒性。(2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。(3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。(4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使 G418(长那霉素衍生物)...
