Western-blot的原理、操作及注意事项

Western blot 的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分,并转移至固相支持物,通过特异性试剂(抗体）作为探针，对靶物质进行检测,蛋白质的 Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至 1～5ng（最低可到 10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入 3 倍体积预冷的 PBS,0℃研磨，加入 5×STOP buffer,180W，6mins，0℃超声波破裂，5000rpm,5mins 离心,取上清。加入 β—ME(9.5ml加入 0。5ml），溴酚蓝（9。5ml 加入 0.5ml)煮沸 10min，分装后于—20℃保存,用时取出，直接溶解上样。2 细胞：细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培育瓶内加入 5×STOP buffer,收集,180W，6mins，0℃超声波破裂,5000rpm,5mins 离心，取上清。加入 β—ME(9。5ml 加入0。5ml），溴酚蓝(9。5ml 加入 0。5ml）煮沸 10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入 β-ME、溴酚蓝制样。B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法.在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是 Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在 540nm 波长处有最大吸收。双缩脲法常用于 0.5g/L～10g/L 含量的蛋白质溶液测定.干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如 Tris、Good 缓冲液等.可用沉淀法除去干扰物，即用等体积 10％冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的 1m NaOH 溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。2.Lowry 法：此法是双缩脲法的进一步进展。他的第一步就是双缩脲反应，即 Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷—磷钨酸试剂(福林—酚试剂)，结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定 20mg/L~400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同,而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性 pH 环境中才稳定,上述提到的还原反应只有在 pH10 时才发生，因此,福林试剂加入到碱性的 Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立即搅拌,以使磷钼酸—磷钨酸试剂在未...